Summary

Recolección dinámica en tiempo real de líquido extracelular del hipocampo de ratas conscientes utilizando un sistema de microdiálisis

Published: October 21, 2022
doi:

Summary

El protocolo aquí proporciona un muestreo dinámico detallado en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo de ratas despiertas utilizando un sistema de microdiálisis.

Abstract

Una variedad de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) se asocian con cambios en la composición del líquido extracelular del hipocampo (HECF). Sin embargo, la dificultad para obtener HECF en tiempo real de ratas conscientes ha restringido durante mucho tiempo la evaluación de la progresión de la enfermedad del SNC y la efectividad de la terapia con etnomedicina. Alentadoramente, una técnica de microdiálisis cerebral se puede utilizar para el muestreo continuo con las ventajas de la observación dinámica, el análisis cuantitativo y un tamaño de muestreo pequeño. Esto permite el monitoreo de los cambios en el contenido de líquido extracelular para compuestos de hierbas tradicionales y sus metabolitos en el cerebro de animales vivos. El objetivo de este estudio fue, por lo tanto, implantar con precisión una sonda de microdiálisis de líquido cefalorraquídeo en la región del hipocampo de ratas Sprague Dawley (SD) con un aparato estereotáxico cerebral tridimensional, cortando pesos moleculares superiores a 20 kDa. El HECF de alta calidad se obtuvo de ratas conscientes utilizando un sistema de control de muestreo de microdiálisis con una frecuencia de muestreo ajustable de 2,87 nL/min – 2,98 ml/min. En conclusión, nuestro protocolo proporciona un método eficiente, rápido y dinámico para obtener HECF en ratas despiertas con la ayuda de la tecnología de microdiálisis, lo que nos brinda posibilidades ilimitadas para explorar más a fondo la patogénesis de las enfermedades relacionadas con el SNC y evaluar la eficacia de los medicamentos.

Introduction

Las enfermedades del sistema nervioso central (SNC) con altas morbilidades, como las enfermedades neurodegenerativas, la lesión cerebral traumática, la lesión cerebral inducida por hipoxia a gran altitud y el accidente cerebrovascular isquémico, son causas cruciales de la creciente mortalidad en todo el mundo 1,2,3. El monitoreo en tiempo real de citoquinas y cambios de proteínas en regiones específicas del cerebro contribuye a la precisión diagnóstica de las enfermedades del SNC y los estudios farmacocinéticos cerebrales después de la medicación. La investigación científica tradicional utiliza homogeneizado de tejido cerebral o una colección manual de líquido cerebral intersticial animal para la detección de sustancias específicas y para estudios farmacocinéticos. Sin embargo, esto tiene algunas deficiencias, como un tamaño de muestra limitado, la incapacidad de observar dinámicamente los cambios de los indicadores y una calidad de muestreo desigual 4,5,6. El líquido cefalorraquídeo, un líquido intersticial, protege el cerebro y la médula espinal del daño mecánico. Su composición es diferente a la del suero debido a la existencia de la barrera hematoencefálica (BHE)7. El análisis directo de muestras de líquido cefalorraquídeo es más propicio para revelar el mecanismo de las lesiones del SNC y el descubrimiento de fármacos. Inevitablemente, las muestras de líquido cefalorraquídeo, obtenidas manualmente directamente de la cisterna magna y los ventrículos cerebrales a través de una jeringa, tienen desventajas de contaminación sanguínea, probabilidad aleatoria de recolección de muestras, incertidumbre cuantitativa y casi ninguna posibilidad de recuperación múltiple 8,9. Más notablemente, los métodos convencionales de muestreo de líquido cerebral intersticial no pueden obtener muestras de regiones cerebrales dañadas, lo que dificulta la exploración de la patogénesis de las enfermedades del SNC en regiones específicas del cerebro y la evaluación de la eficacia de las terapias dirigidas de etnomedicina 9,10.

La microdiálisis cerebral es una técnica para el muestreo de líquido cerebral intersticial en animales despiertos11. El sistema de microdiálisis imita la permeabilidad vascular con la ayuda de una sonda implantada en el cerebro. La sonda de microdiálisis está armada con una membrana semipermeable y se implanta en regiones específicas del cerebro. Después de la perfusión con líquido cefalorraquídeo artificial isotónico (ACSF), el líquido cerebral intersticial dializado puede ser recolectado favorablemente con los beneficios de tamaños de muestra pequeños, muestreo continuo y observación dinámica12,13. En términos de localización, las sondas de microdiálisis cerebral pueden ser implantadas selectivamente en estructuras cerebrales o cisternas craneales de interés14. Una observación de niveles anormales de una sustancia endógena en el líquido extracelular del hipocampo (HECF) sugiere la aparición de enfermedades del SNC o la patogénesis de la enfermedad. Varios estudios han demostrado que los biomarcadores para enfermedades del SNC, como los D-aminoácidos en la esquizofrenia, las proteínas β-amiloide y tau en la enfermedad de Alzheimer, las cadenas ligeras de neurofilamentos en la lesión cerebral traumática y la ubiquitina carboxi-terminal hidrolasa L1s en la encefalopatía por isquemia hipóxica, pueden analizarse en el líquido cefalorraquídeo15,16,17 . Un método de análisis químico basado en la técnica de muestreo de microdiálisis cerebral puede ser utilizado para monitorear cambios dinámicos de compuestos exógenos como los ingredientes activos de la etnomedicina, que se difunden y distribuyen en regiones específicas del cerebro14.

Este artículo presenta el proceso específico de adquisición dinámica de HECF en ratas despiertas y mide su presión osmótica para garantizar la calidad de la muestra.

Protocol

El protocolo experimental se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos del Comité de Uso de Animales de Laboratorio y Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2021-11). Para el presente estudio se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (280 ± 20 g, 6-8 semanas de edad). 1. Cirugía de implantación de sonda de microdiálisis cerebral Utilizar isoflurano al 3% y 1,5% para la inducc…

Representative Results

Siguiendo el protocolo experimental anterior y los parámetros de muestreo establecidos en la Tabla 1, se obtuvo HECF de rata similar al agua, incolora y transparente a la velocidad de muestreo establecida (Figura 1K). La presión osmótica del HECF de rata obtenido fue de 290-310 mOsm/L, lo que puede asegurar indirectamente la calidad de las muestras18,19. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.withi…

Discussion

La patogénesis de las enfermedades del SNC aún no se comprende completamente, lo que dificulta el desarrollo de nuevas terapias y medicamentos. Estudios han demostrado que la mayoría de las enfermedades del SNC están estrechamente relacionadas con las lesiones del hipocampo20,21,22. La técnica de microdiálisis cerebral propuesta puede dirigirse a regiones específicas del cerebro, especialmente el hipocampo, lo que lo hace…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82104533), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (2021YJ0175) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2020M683273). Los autores desean agradecer al Sr. Yuncheng Hong, ingeniero senior de equipos de Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapur) por la prestación de servicios técnicos para la técnica de microdiálisis.

Materials

 Air-drying oven Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd GHG-9240A
Animal anesthesia system Rayward Life Technology Co., Ltd R500IE
Animal temperature maintainer Rayward Life Technology Co., Ltd 69020
Artificial cerebrospinal fluid Beijing leagene biotech. Co., Ltd CZ0522
Brain microdialysis probe  CMA Microdialysis AB T56518
Catheter  CMA Microdialysis AB T56518
Covance infusion harness Instech Laboratories, Inc. CIH95
Denture base resins Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd 190732
Electric cranial drill Rayward Life Technology Co., Ltd 78001
Electric shaver Rayward Life Technology Co., Ltd CP-5200
Free movement tank for animals  CMA Microdialysis AB CMA120
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd H51021208
Iodophor Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd 202201
Isofluran Rayward Life Technology Co., Ltd R510-22
Microdialysis catheter stylet  CMA Microdialysis AB 8011205
Microdialysis collection tube  CMA Microdialysis AB 7431100
Microdialysis collector  CMA Microdialysis AB CMA4004
Microdialysis fep tubing  CMA Microdialysis AB 3409501
Microdialysis in vitro stand  CMA Microdialysis AB CMA130
Microdialysis microinjection pump  CMA Microdialysis AB 788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB 8309020
Microdialysis tubing adapter  CMA Microdialysis AB 3409500
Non-absorbable surgical sutures Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd S19004
Ophthalmic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F12016-15
Osmometer Löser OM 807
Sodium hyaluronate eye drops URSAPHARM Arzneimittel GmbH H20150150
Stereotaxie apparatus Rayward Life Technology Co., Ltd 68025
Surgical scissors Rayward Life Technology Co., Ltd S14014-15
Surgical scissors Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd BY-103
Syringe needle  CMA Microdialysis AB T56518
Trypsin solution Boster
Biological Technology, Ltd.
PYG0107
Ultrasonic cleaner Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd KMH1-240W8101

References

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Citer Cet Article
Wang, X., Xie, N., Zhang, Y., Meng, X., Hou, Y., Zhang, S. Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System. J. Vis. Exp. (188), e64530, doi:10.3791/64530 (2022).

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