La quantification de la zone de contact et de la force appliquée par la pointe d’une sonde de microscope à force atomique (AFM) à une surface d’échantillon permet de déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique. Les meilleures pratiques pour mettre en œuvre la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM dans l’air ou le fluide sur des échantillons mous et durs pour mesurer le module d’élasticité ou d’autres propriétés nanomécaniques sont discutées.
Un microscope à force atomique (AFM) mesure fondamentalement l’interaction entre la pointe d’une sonde AFM à l’échelle nanométrique et la surface de l’échantillon. Si la force appliquée par la pointe de la sonde et sa zone de contact avec l’échantillon peuvent être quantifiées, il est possible de déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique (par exemple, élastique ou module de Young) de la surface sondée. Une procédure détaillée pour effectuer des expériences quantitatives de nanoindentation AFM basées sur le porte-à-faux est fournie ici, avec des exemples représentatifs de la façon dont la technique peut être appliquée pour déterminer les modules élastiques d’une grande variété de types d’échantillons, allant de kPa à GPa. Il s’agit notamment de cellules souches mésenchymateuses vivantes (CSM) et de noyaux dans un tampon physiologique, de sections transversales de pin loblolly déshydraté incorporées dans la résine et de schistes de Bakken de composition variable.
De plus, la nanoindentation en porte-à-faux AFM est utilisée pour sonder la résistance à la rupture (c’est-à-dire la force de percée) des bicouches phospholipidiques. D’importantes considérations pratiques telles que le choix et le développement de la méthode, la sélection et l’étalonnage de la sonde, l’identification de la région d’intérêt, l’hétérogénéité de l’échantillon, la taille et le rapport d’aspect des caractéristiques, l’usure de la pointe, la rugosité de surface et l’analyse des données et les statistiques de mesure sont discutées pour faciliter la mise en œuvre correcte de la technique. Enfin, la colocalisation de cartes nanomécaniques dérivées de l’AFM avec des techniques de microscopie électronique qui fournissent des informations supplémentaires sur la composition élémentaire est démontrée.
Comprendre les propriétés mécaniques des matériaux est l’une des tâches les plus fondamentales et essentielles de l’ingénierie. Pour l’analyse des propriétés des matériaux en vrac, il existe de nombreuses méthodes pour caractériser les propriétés mécaniques des systèmes de matériaux, y compris les essais de traction1, les essais de compression2 et les essais de flexion à trois ou quatre points (flexion)3. Bien que ces tests à l’échelle microscopique puissent fournir des informations précieuses sur les propriétés des matériaux en vrac, ils sont généralement effectués jusqu’à la défaillance et sont donc destructeurs. De plus, ils n’ont pas la résolution spatiale nécessaire pour étudier avec précision les propriétés à l’échelle micro et nanométrique de nombreux systèmes de matériaux qui présentent un intérêt aujourd’hui, tels que les couches minces, les matériaux biologiques et les nanocomposites. Pour commencer à résoudre certains des problèmes liés aux essais mécaniques à grande échelle, principalement sa nature destructive, les essais de microdureté ont été adoptés à partir de la minéralogie. La dureté est une mesure de la résistance d’un matériau à la déformation plastique dans des conditions spécifiques. En général, les tests de microdureté utilisent une sonde rigide, généralement en acier trempé ou en diamant, pour s’indenter dans un matériau. La profondeur et/ou la surface d’indentation résultante peuvent ensuite être utilisées pour déterminer la dureté. Plusieurs méthodes ont été développées, y compris la dureté Vickers4, Knoop5 et Brinell6 ; Chacun fournit une mesure de la dureté du matériau à l’échelle microscopique, mais dans des conditions et des définitions différentes, et ne produit donc que des données qui peuvent être comparées à des essais effectués dans les mêmes conditions.
La nanoindentation instrumentée a été développée pour améliorer les valeurs relatives obtenues via les différentes méthodes d’essai de microdureté, améliorer la résolution spatiale possible pour l’analyse des propriétés mécaniques et permettre l’analyse des couches minces. Il est important de noter qu’en utilisant la méthode développée pour la première fois par Oliver et Pharr7, l’élastique ou le module de Young, E, d’un matériau échantillon peut être déterminé par nanoindentation instrumentée. En outre, en utilisant une sonde de nanopénétrateur pyramidal à trois côtés Berkovich (dont la fonction d’aire de pointe idéale correspond à celle de la sonde pyramidale à quatre côtés Vickers)8, il est possible d’effectuer une comparaison directe entre les mesures de dureté à l’échelle nanométrique et à l’échelle microscopique plus traditionnelles. Avec la popularité croissante de l’AFM, la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM a également commencé à attirer l’attention, en particulier pour mesurer les propriétés mécaniques des matériaux plus mous. En conséquence, comme illustré schématiquement à la figure 1, les deux techniques les plus couramment utilisées aujourd’hui pour interroger et quantifier les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique sont la nanoindentation instrumentée (Figure 1A) et la nanoindentation en porte-à-faux AFM (Figure 1B)9, cette dernière étant au centre de ce travail.
Figure 1 : Comparaison des systèmes instrumentés et des systèmes de nanoindentation en porte-à-faux AFM. Diagrammes schématiques illustrant des systèmes typiques pour la conduite (A) de nanoindentation instrumentée et (B) de nanoindentation en porte-à-faux AFM. Ce chiffre a été modifié à partir de Qian et al.51. Abréviation : AFM = microscopie à force atomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La nanoindentation instrumentée et la nanoindentation en porte-à-faux AFM utilisent une sonde rigide pour déformer une surface d’échantillon d’intérêt et surveiller la force et le déplacement résultants en fonction du temps. En règle générale, le profil de déplacement de la charge souhaitée (c’est-à-dire la force) ou le profil de déplacement (Z-piézo) est spécifié par l’utilisateur via l’interface du logiciel et directement contrôlé par l’instrument, tandis que l’autre paramètre est mesuré. La propriété mécanique la plus souvent obtenue à partir d’expériences de nanoindentation est le module élastique (E), également appelé module de Young, qui a des unités de pression. Le module d’élasticité d’un matériau est une propriété fondamentale relative à la rigidité de liaison et est défini comme le rapport de la contrainte de traction ou de compression (σ, la force appliquée par unité de surface) à la déformation axiale (ε, la déformation proportionnelle le long de l’axe d’indentation) pendant la déformation élastique (c’est-à-dire réversible ou temporaire) avant le début de la déformation plastique (équation [1]):
(1)
Il convient de noter que, parce que de nombreux matériaux (en particulier les tissus biologiques) sont en fait viscoélastiques, en réalité, le module (dynamique ou complexe) est constitué à la fois de composants élastiques (stockage, en phase) et visqueux (perte, déphasés). Dans la pratique, ce qui est mesuré dans une expérience de nanoindentation est le module réduit, E *, qui est lié au véritable module d’intérêt de l’échantillon, E, comme le montre l’équation (2):
(2)
Où E pointe et ν pointe sont respectivement le module d’élasticité et le rapport de Poisson de la pointe nanopénétreur, et ν est le rapport de Poisson estimé de l’échantillon. Le rapport de Poisson est le rapport négatif de la déformation transversale à la déformation axiale, et indique donc le degré d’allongement transversal d’un échantillon lorsqu’il est soumis à une déformation axiale (par exemple, pendant la charge de nanoindentation), comme le montre l’équation (3):
(3)
La conversion du module réduit au module réel est nécessaire parce que a) une partie de la déformation axiale conférée par la pointe du pénétrateur peut être convertie en déformation transversale (c’est-à-dire que l’échantillon peut se déformer par expansion ou contraction perpendiculairement à la direction de chargement), et b) la pointe du pénétrateur n’est pas infiniment dure, et donc l’acte d’indenter l’échantillon entraîne une certaine (petite) déformation de la pointe. Notez que dans le cas où la pointe E >> E (c’est-à-dire que la pointe du pénétrateur est beaucoup plus dure que l’échantillon, ce qui est souvent vrai lors de l’utilisation d’une sonde en diamant), la relation entre le module d’échantillon réduit et réel se simplifie grandement à E ≈ E*(1 – v2). Alors que la nanoindentation instrumentée est supérieure en termes de caractérisation précise de la force et de plage dynamique, la nanoindentation en porte-à-faux AFM est plus rapide, fournit des ordres de grandeur plus de force et de sensibilité au déplacement, permet une imagerie à plus haute résolution et une localisation améliorée de l’indentation, et peut sonder simultanément les propriétés magnétiques et électriques à l’échelle nanométrique9. En particulier, la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM est supérieure pour la quantification des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique des matériaux mous (par exemple, polymères, gels, bicouches lipidiques et cellules ou autres matériaux biologiques), des films extrêmement minces (sub-μm) (où les effets du substrat peuvent entrer en jeu en fonction de la profondeur d’indentation)10,11 et des matériaux bidimensionnels (2D) en suspension12,13,14 tels que le graphène 15,16, mica17, nitrure de bore hexagonal (h-BN)18 ou dichalcogénures de métaux de transition (TMDC; p. ex. MoS2)19. Cela est dû à sa force exquise (sub-nN) et à sa sensibilité au déplacement (sub-nm), ce qui est important pour déterminer avec précision le point de contact initial et rester dans la région de déformation élastique.
Dans la nanoindentation en porte-à-faux AFM, le déplacement d’une sonde AFM vers la surface de l’échantillon est actionné par un élément piézoélectrique étalonné (Figure 1B), le porte-à-faux flexible finissant par se plier en raison de la force résistive ressentie au contact de la surface de l’échantillon. Cette flexion ou déviation du porte-à-faux est généralement surveillée en réfléchissant un laser à l’arrière du porte-à-faux et dans un photodétecteur (détecteur sensible à la position [PSD]). Couplé à la connaissance de la rigidité en porte-à-faux (en nN/nm) et de la sensibilité à la déflexion (en nm/V), il est possible de convertir cette déformation en porte-à-faux mesurée (en V) en force (en nN) appliquée à l’échantillon. Après contact, la différence entre le mouvement Z-piézo et la déviation en porte-à-faux donne la profondeur d’indentation de l’échantillon. Combiné à la connaissance de la fonction de zone de pointe, cela permet de calculer la surface de contact de l’échantillon de pointe. La pente des parties en contact des courbes force-distance ou force-déplacement (F-D) résultantes peut ensuite être ajustée à l’aide d’un modèle de mécanique de contact approprié (voir la section Analyse des données de la discussion) pour déterminer les propriétés nanomécaniques de l’échantillon. Bien que la nanoindentation en porte-à-faux AFM présente certains avantages distincts par rapport à la nanoindentation instrumentée décrite ci-dessus, elle présente également plusieurs défis pratiques de mise en œuvre, tels que l’étalonnage, l’usure des pointes et l’analyse des données, qui seront discutés ici. Un autre inconvénient potentiel de la nanoindentation en porte-à-faux AFM est l’hypothèse d’élasticité linéaire, car le rayon de contact et les profondeurs d’indentation doivent être beaucoup plus petits que le rayon de pénétration, ce qui peut être difficile à réaliser lorsque vous travaillez avec des sondes AFM à l’échelle nanométrique et / ou des échantillons présentant une rugosité de surface importante.
Traditionnellement, la nanoindentation a été limitée à des emplacements individuels ou à de petites expériences d’indentation de grille, dans lesquelles un emplacement souhaité (c’est-à-dire une région d’intérêt [ROI]) est sélectionné et un seul retrait contrôlé, plusieurs retraits dans un seul endroit séparés par un certain temps d’attente et / ou une grille grossière de retraits sont effectués à une vitesse de l’ordre de Hz. Cependant, les progrès récents de l’AFM permettent l’acquisition simultanée des propriétés mécaniques et de la topographie grâce à l’utilisation de modes d’imagerie basés sur des courbes de force à grande vitesse (désignés par divers noms commerciaux selon le fabricant du système), dans lesquels les courbes de force sont conduites à une vitesse de kHz sous contrôle de charge, la force maximale de l’échantillon de pointe étant utilisée comme point de consigne d’imagerie. Des méthodes point-and-shoot ont également été développées, permettant l’acquisition d’une image topographique AFM suivie d’une nanoindentation sélective ultérieure aux points d’intérêt de l’image, permettant un contrôle spatial à l’échelle nanométrique sur l’emplacement de la nanoindentation. Bien que ce ne soit pas l’objectif principal de ce travail, des exemples d’application spécifiques sélectionnés de l’imagerie basée sur la courbe de force et de la nanoindentation en porte-à-faux point-and-shoot sont présentés dans les résultats représentatifs et peuvent être utilisés conjointement avec le protocole décrit ci-dessous s’il est disponible sur la plate-forme AFM particulière utilisée. Plus précisément, ce travail décrit un protocole généralisé pour la mise en œuvre pratique de la nanoindentation AFM basée sur le porte-à-faux sur tout système AFM capable et fournit quatre exemples de cas d’utilisation (deux dans l’air, deux dans le fluide) de la technique, y compris des résultats représentatifs et une discussion approfondie des nuances, des défis et des considérations importantes pour utiliser avec succès la technique.
Préparation des échantillons
Pour la nanoindentation dans l’air, les méthodes de préparation courantes comprennent la cryosectionnement (p. ex., échantillons de tissus), le broyage et/ou le polissage suivi d’un ultramicrotoming (p. ex., échantillons biologiques incorporés dans la résine), le broyage ionique ou la préparation par faisceau d’ions focalisés (p. ex. échantillons semi-conducteurs, poreux ou de dureté mixte ne se prêtant pas au polissage), le polissage mécanique ou élec…
The authors have nothing to disclose.
Toutes les expériences AFM ont été réalisées au Boise State University Surface Science Laboratory (SSL). La caractérisation SEM a été réalisée au Boise State Center for Materials Characterization (BSCMC). Les recherches rapportées dans cette publication concernant les matières premières de biocarburants ont été soutenues en partie par le Département de l’énergie des États-Unis, l’Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, le Bioenergy Technologies Office dans le cadre du Feedstock Conversion Interface Consortium (FCIC) et dans le cadre du contrat DE-AC07-051ID14517 du Bureau des opérations du DOE de l’Idaho. Les études sur la mécanique cellulaire ont été financées par les National Institutes of Health (États-Unis) dans le cadre de subventions AG059923, AR075803 et P20GM109095, et par des subventions de la National Science Foundation (États-Unis) 1929188 et 2025505. Les travaux sur les systèmes bicouches lipidiques modèles ont été soutenus par les National Institutes of Health (États-Unis) dans le cadre de la subvention R01 EY030067. Les auteurs remercient le Dr Elton Graugnard d’avoir produit l’image composite illustrée à la figure 11.
Atomic force microscope | Bruker | Dimension Icon | Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces |
AtomicJ | American Institute of Physics | https://doi.org/10.1063/1.4881683 | Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683 |
Buffer solution (PBS) | Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4) | S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4) | Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use. |
Chloroform | |||
Diamond tip AFM probe | Bruker | PDNISP | Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe. |
Diamond ultramicrotome blade | Diatome | Ultra 35° | 2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation |
Epoxy | Gorilla Glue | 26853-31-6 | Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes. |
Ethanol | |||
LR white resin, medium grade (catalyzed) | Electron Microscopy Sciences | 14381 | 500 mL bottle, Lot #150629 |
Mesenchymal stem cells (MSCs) | N/A | N/A | MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070. |
Modulus standards | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E – 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck). |
Muscovite mica | Ted Pella | 50-12 | 12 mm diameter, V1 grade muscovite mica |
Nanscope Analysis | Bruker | Version 2.0 | Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves. |
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine) | Avanti Polar Lipids | POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5 | POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL). |
Probe holder (fluid, lipid bilayers) | Bruker | MTFML-V2 | Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM. |
Probe holder (fluid, MSCs) | Bruker | FastScan Bio Z-scanner | Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154. |
Probe holder (standard, ambient) | Bruker | DAFMCH | Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping) |
Sample Puck | Ted Pella | 16218 | Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459 |
Sapphire substrate | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit. |
Scanning electron microscope | Hitachi | S-3400N-II | Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V. |
Silicon AFM probes (standard) | NuNano | Scout 350 | Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2). |
Silicon AFM probes (stiff) | Bruker | RTESPA-525, RTESPA-525-30 | Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe. |
Silicon carbide grit paper (abrasive discs) | Allied | 50-10005 | 120 grit |
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip) | Bruker | MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC | Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m. |
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip) | Bruker | DNP | 4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm. |
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip) | Bruker | ScanAsyst-Air | Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging. |
Superglue | Henkel | Loctite 495 | Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available. |
Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000US | One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity |
Tip characterization standard | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit. |
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999% | Norco | SPG TUHPNI – T | T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples |
Ultramicrotome | Leica | EM UC6 | Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation) |
Ultrapure water | Thermo Fisher | Barnstead Nanopure Model 7146 | Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber. |
Variable Speed Grinder | Buehler | EcoMet 3000 | Used with silicon carbide grit papers during hand polishing. |
Vibration isolation table (active) | Herzan | TS-140 | Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab). |
Vibration isolation table (passive) | TMC | 65-531 | 35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top. |