הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור
Summary
מיקרוסקופ יריעות אור פותח כדי לצלם ולהפוך שבלול שלם לדיגיטלי.
Abstract
חירשות היא הליקוי החושי הנפוץ ביותר, המשפיע על כ -5% או 430 מיליון אנשים ברחבי העולם על פי ארגון הבריאות העולמי1. הזדקנות או פרסביקוזיס היא הגורם העיקרי לאובדן שמיעה תחושתי-עצבי והיא מאופיינת בנזק לתאי שיער, נוירוני גנגליון ספירליים (SGNs) והסטריה וסקולריס. מבנים אלה שוכנים בתוך השבלול, שיש לו אנטומיה מורכבת בצורת ספירלה של רקמות קרומיות המרחפים בנוזל ומוקפים בעצם. תכונות אלה מקשות מבחינה טכנית לחקור ולכמת שינויים היסטופתולוגיים. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו מיקרוסקופ גיליון אור (TSLIM) שיכול לצלם ולהפוך את השבלול כולו לדיגיטלי כדי להקל על חקר יחסי מבנה-תפקוד באוזן הפנימית. מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול כולו יוצרים ערימה של תמונות לעיבוד נפח תלת-ממדי (תלת-ממדי) ופילוח של מבנים בודדים לצורך הדמיה תלת-ממדית וניתוח כמותי (כלומר, אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר). שבלול דורש שלבי עיבוד מינימליים (קיבוע, הסתיידות, התייבשות, צביעה וניקוי אופטי), שכולם תואמים לדימות ברזולוציה גבוהה לאחר מכן על ידי סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור. מכיוון שכל הרקמות נמצאות בערימות, ניתן להעריך כל מבנה בנפרד או ביחס למבנים אחרים. בנוסף, מאחר שההדמיה משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות, ניתן להשתמש באימונוהיסטוכימיה ובקשירת ליגנדים כדי לזהות מבנים ספציפיים ואת נפחם או פיזורם התלת-ממדי בתוך השבלול. כאן השתמשנו ב-TSLIM כדי לבחון שבלול מעכברים מזדקנים כדי לכמת את אובדן תאי השערה ותאי העצב בגנגליון ספירלי. בנוסף, נעשה שימוש באנליזות מתקדמות (למשל, ניתוח אשכולות) כדי להמחיש הפחתה מקומית של נוירוני גנגליון ספירליים בתעלה של רוזנטל לאורך נפחה התלת-ממדי. גישות אלה מדגימות את יכולתו של מיקרוסקופ TSLIM לכמת יחסי מבנה-פונקציה בתוך שבלול ובין שבלול.
Introduction
השבלול הוא איבר החישה ההיקפי לשמיעה אצל יונקים. יש לו אנטומיה ספירלית מורכבת של תאים חושיים ותומכים חוזרים המתמחים אנטומית כדי לזהות תנודות קול ולהעבירם למוח לתפיסת השמיעה. מרכיבי החישה העיקריים הם תאי השערה הפנימיים והחיצוניים וסיבי העצב המעצבבים שלהם, שגופם התא מרכיב את הגנגליון הספירלי, השוכן בתוך התעלה של רוזנטל (איור 1). מבנים חושיים ועצביים אלה מסודרים באופן טונוטופי כך שצלילים בתדר גבוה מומרים בבסיס השבלול וצלילים בתדר נמוך מומרים בקודקודהשבלול 2. מפה אנטומית של התפלגות תאים חושיים זו לאורך הספירלי של הממברנה הבזילארית התומכת נקראת ציטוקוכלאוגרמה3 וניתן להשוות אותה עם ליקוי שמיעה כפונקציה של תדר כפי שמתואר באודיוגרמה.
המבוך הקרומי של השבלול, המוקף בעצם צפופה, מקשה מבחינה טכנית לבחון יותר ממבנה שבלול אחד בכל פעם. לכן, הרציונל לפיתוח מיקרוסקופ יריעות אור הוא לייצר מקטעים טוריים מיושרים היטב של השבלול השלם, כך שניתן יהיה לבחון את כל מבני השבלול ביחס זה לזה בשחזורים תלת-ממדיים. Voie et al.4 ו-Voie and Spelman5 תכננו את המיקרוסקופ הראשון של יריעות אור, שנקרא מיקרוסקופ חתך אופטי פלואורסצנטי מישורי אורתוגונלי (OPFOS), כדי לחתוך אופטית את כל השבלול. עם זאת, מיקרוסקופ זה מעולם לא פותח מסחרית; לכן, מטרתנו הייתה לבנות מיקרוסקופ גיליון אור שנקרא מיקרוסקופ הדמיה לייזר דק (TSLIM; איור 2). פרטי התכנון והבנייה של TSLIM פורסמו בעבר8. TSLIM ביצעה מספר שיפורים לעומת OPFOS, כולל שימוש במצלמה דיגיטלית בתאורה חלשה לעומת מצלמת CCD לאיסוף תמונות, מיקרופוזיציות מקודדות אופטית לתנועה מדויקת וניתנת לשחזור של הדגימה דרך יריעת האור, שימוש בתא דגימה זמין מסחרית ושקוף אופטית, וצביעת רודמין באתנול במקום בתמיסת הניקוי למניעת משקעים של כתמים בתוך הרקמה. הפיתוח המסחרי של מיקרוסקופים קלילים כגון SPIM6 התמקד בהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות חיות ושקופות קטנות, אך הם אינם מתאימים לדימות שבלול שלם מכיוון שאין להם מרחק עבודה מספיק. סקירה של התפתחות מיקרוסקופים אחרים של יריעות אור פורסמה על ידי Santi7. היתרון העיקרי של TSLIM על פני שיטות היסטולוגיות אחרות לבדיקת השבלול הוא חתך רקמות אופטיות לשחזור תלת ממדי תוך שמירה על שלמות הדגימה, כך שניתן יהיה להשתמש בה בשיטות היסטולוגיות אחרות. יתרון נוסף של הדמיית TSLIM הוא שרק יריעת אור דקה המיוצרת על ידי לייזר נחשפת לרקמה, לעומת חשיפה לעובי רקמה שלמה ללייזר כמו במיקרוסקופ קונפוקלי. ניקוי רקמות כדי למזער את פיזור האור והעובדה שרק חלק קטן מהרקמה חשוף ללייזר מביא לדעיכה מינימלית של פלואורוכרום (פוטו-הלבנה) באמצעות הדמיית לייזר של יריעות אור. עם זאת, תהליך הקיבוע, ההתייבשות והניקוי משנה את המורפולוגיה של מבני השבלול וגורם להתכווצות הרקמה בהשוואה לרקמה חיה. כמות התכווצות הרקמה המתרחשת בפועל לא נקבעה.
TSLIM פותחה על ידי שיין ג’ונסון ושמונה סטודנטים גרמנים להנדסה אופטית (ראו תודות). פרטי הבנייה של TSLIM סופקו על ידי Santi et al.8 וגרסת סריקה (sTSLIM) על ידי Schröter et al.9. TSLIM מתפקד כמיקרוטום לא הרסני לחיתוך אופטי של דגימות וכמיקרוסקופ לאיסוף מקטעים טוריים דו-ממדיים דרך מלוא רוחב ועובי השבלול. TSLIM יכול לצלם דגימות קטנות (מ”מ) וגדולות (ס”מ), עבות. העדשות מותקנות באוויר כדי לאפשר מרחקי עבודה ארוכים עם יעדי איסוף של 1x ו-2x במיקרוסקופ דיסקציה. למיקרוסקופ הדיסקציה יש גם אופטיקת זום המאפשרת ל-TSLIM לפתור מבנים תת-תאיים וסינפטיים בתאים. TSLIM מצויד בלייזר כחול (473 ננומטר) וירוק (532 ננומטר) להארה המאפשרת שימוש במגוון בדיקות פלורסנט להדמיה. המטרה של TSLIM היא לייצר מקטעים אופטיים דו-ממדיים מיושרים היטב דרך שבלול שלם לשחזור דיגיטלי מלא של רקמות השבלול. מכיוון שמדובר בשיטה פלואורסצנטית, ליגנדות ואימונוהיסטוכימיה יכולות לשמש גם לזיהוי מבני שבלול ספציפיים.
בתחילה, עדשה גלילית שימשה לייצור שתי יריעות אור גאוסיאניות מנוגדות, אך היא הפיקה ממצאי דימות בליעה. בשל עבודתם של קלר ואחרים 10, העדשה הגלילית הקבועה הוחלפה במראה גלוונומטר סורקת כדי לייצר את גיליון האור9. נוסף על כך, מאחר שמרכז היריעה הבהירה הוא הדק ביותר במותני הקרן, תמונות sTSLIM 2D מופקות על-ידי איסוף קומפוזיט של עמודות נתונים על ציר X לרוחב הדגימה (איור 3). שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Buytaert ו Dircks11. תוכנת TSLIM מותאמת אישית לנהיגה ואיסוף תמונות פותחה באמצעות תוכנה גרפית לבקרת מכשירים. יריעת האור עוברת דרך הדגימה ומאירה מישור פלואורסצנטי בתוך הרקמה. מישור פלואורסצנטי זה מוקרן באופן אורתוגונלי דרך הדגימה השקופה ונאסף על ידי מיקרוסקופ דיסקציה. מיקרופוזיציות מקודדות אופטית מאפשרות סריקה דרך מותני הקרן בציר X כדי לאסוף תמונה דו-ממדית מורכבת אחת, ולאחר מכן, המיקרופוזיציה של ציר Z מעבירה את הדגימה למישור עמוק יותר בתוך הרקמה כדי לקבל ערימה של תמונות דו-ממדיות טוריות חתוכות (וידאו 1, איור 4). ערימה של תמונות תרגום נאספת לכל רוחב, עובי ואורך השבלול, ואין צורך בתפירת תמונות (סרטון 2). מחסנית התמונות מועברת למחשב אחר ונטענת לתוכנית עיבוד תלת ממדית לשחזור וכימות תלת מימדי. ערימות התמונות מכילות את כל המידע הדיגיטלי על המורפולוגיה של שבלול ברזולוציה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם נדרשת רזולוציה גבוהה יותר, השבלול השלם יכול להיות מעובד עוד יותר על ידי שיטות היסטולוגיות הרסניות כגון חתך מיקרוטום, סריקה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
תוכנית העיבוד התלת-ממדית משמשת לפלח מבני שבלול שונים עבור עיבוד תלת-ממדי וניתוח כמותי. לצורך סגמנטציה, כל מבנה בכל תמונה דו-ממדית של הערימה מתבצע באמצעות צבע שונה באמצעות לוח ועט גרפיים (איור 5). עד כה חולקו 20 מבני שבלול שונים (איור 6). לאחר הפילוח ניתן לבצע מגוון ניתוחים תלת ממדיים. לדוגמה, תוכנת עיבוד תלת-ממדית יכולה למעשה לכרות מחדש את השבלול בכל מישור לאורך הצנטרואיד של המבנה. סרטון 3 מראה חתך משיק לאיבר של קורטי, אשר חושף את תאי השערה לאורך הקרום הבזילרי. תהליך זה דורש תחילה פילוח ידני של מבנה העניין. לאחר מכן, הצנטרויד של המבנה מחושב על פי התאמת הריבועים הפחותים של נקודות הספליין הממוקמות לאורך מרכז המבנה מבסיסו ועד קודקודו, ובכך מאפשר קירוב של אורך המבנה (סרטון 4). תהליך דומה שנקרא שלד יכול לשמש כדי להמחיש את הרוחב הרדיאלי של המבנה לאורכו באמצעות מפת צבע (וידאו 4). הנפח הכולל של כל מבנה מחושב על-ידי התוכנית לאחר הסגמנטציה, אך ניתן גם לכמת מרחקים יחסיים ולהמחיש אותם באמצעות מפות צבע בתוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 7). ניתן גם לייצא מבנים מפולחים כדי לייצר הדמיות מודל מוגדלות מפלסטיק מוצק (איור 8). נוסף על כך, ספירת תאים חצי-אוטומטית יכולה להתבצע גם באמצעות תוכנת עיבוד תלת-ממדית (איור 9). אימונוהיסטוכימיה וקשירת ליגנדים יכולות לשמש להכתמת מבנים ספציפיים של השבלול, וניתן לבודד את המבנים האלה ממבני שבלול אחרים לצורך הערכה מורפומטרית, כגון הפקת ציטוקוכלאוגרמה (איור 10). ניתן לקבוע אורך, רוחב, משטח, נפח ומספר של כל מבני השבלול מהמודלים התלת-ממדיים, מה שהופך גישה זו לאידיאלית למיפוי נזקי שבלול לליקויים תפקודיים. באופן ספציפי, ניתן להראות ולכמת נזק לשבלול כתוצאה מהזדקנות, טראומה כתוצאה מרעש או עלבונות אחרים בשחזורים תלת-ממדיים של שבלול ממקטעים אופטיים דו-ממדיים. לאחר דיגיטציה של שבלול שבלול, ישנם אלגוריתמי הדמיה רבים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך נזק לשבלול של כל רקמה בתוך השבלול ברישום האנטומי לרקמות שבלול אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
חתך אופטי במיקרוסקופ יריעות אור לבחינת מבני שבלול אינו הרסני מבחינה מכנית כמו שיטות היסטולוגיות מסורתיות אחרות, והוא מספק תצוגה דיגיטלית מלאה של מבני השבלול ביחס זה לזה. שיטות קודמות כגון תכשירים על פני השטח של האיבר של קורטי14 סיפקו מפה של נשירת תאי שיער לאורך הקרום הבזילרי, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות של המכונים הלאומיים לבריאות, קרן קלוג, ותרומות פרטיות של ברידג’ט ספרל וג’ון מקורמיק. TSLIM פותחה בעזרתם המצוינת של מתיאס הילנברנד, קרסטין ג’ון, מייק לוין, מישל לייהר, טוביאס שרוטר, פיטר שאכט, אוליבר דנברג וג’וליאן ווסטר מהאוניברסיטה הטכנית של אילמנאו, גרמניה, בפיקוח המנטורים שלהם (סטפן סינזינגר ורנה תסקה) וג’יימס לגר.
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021)
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. . On making human and animal preparations transparent. , (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
