サルモネラ菌は、サルモネラ菌特異的液胞と細胞質ゾル中の遊離の両方で腸上皮細胞内に侵入して複製します(過剰複製)。ここでは、ImageJを介した2つの相補的な画像分析によってサルモネラ菌の細胞内表現型を定量化し、単一細胞の分解能とスコアリングを達成するためのハイスループット蛍光顕微鏡ベースのプロトコルについて説明します。
サルモネラ菌は、腸上皮に侵入し、サルモネラ菌特異的液胞内および細胞質ゾル中の遊離体の両方で腸細胞内で複製することができる腸内病原体である(細胞質過剰複製)。細胞内複製のこれらの異なる表現型は、病因の異なる経路、すなわち、細胞質過剰複製は炎症性細胞死および腸管腔への押し出しを誘発し、液胞複製は経上皮浸透および全身拡散をもたらす。mCherryとGFPの発現差によって液胞と細胞質細菌の識別を可能にするpCHAR-Duo蛍光レポータープラスミドなど、侵入細胞内のサルモネラ菌の挙動を研究するための顕微鏡ツールを作成するために多大な努力が払われました。しかし、細胞内の表現型は手動でスコアリングされることが多く、解析を少数のサンプルや細胞に限定する時間のかかる手順です。これらの制限を克服するために、無料で入手できる画像解析ソフトウェアであるImageJを使用して、2つの補完的で自動化された画像解析が開発されました。ハイスループットプロトコルでは、96ウェルプレートを使用して、上皮細胞をpCHAR-Duoを運ぶサルモネラ菌に感染させました。イメージングは自動蛍光顕微鏡を用いて行った。次に、2つの画像解析方法を適用して、サルモネラ菌の細胞内挙動を異なる詳細レベルで測定しました。第1の方法は、全体的な細胞内細菌負荷および細胞質過剰複製の程度を測定する。高速で、多数の細胞やサンプルのスコアリングが可能なため、スクリーニング実験などのハイスループットアッセイに適しています。2番目の方法では、シングルセル分析を実行して、感染細胞の割合、サルモネラ菌の平均液胞負荷、および細胞質ゾル過剰複製率を決定し、上皮細胞内のサルモネラ菌の挙動に関する詳細を提供します。プロトコルは、サルモネラ菌と腸細胞相互作用の主要なステップのバッチ分析を自動的に実行するために特別に設計されたImageJスクリプトによって実行できます。
サルモネラ 菌は、欧州連合で食品媒介性疾患の発生を引き起こす最も頻繁に報告されている細菌剤です1。 サルモネラ 感染症の主な病理学的症状は腸炎であり、これは摂取後の腸内の病原体の行動とその結果としての局所炎症反応の結果です2。ただし、 サルモネラ菌 は腸外部位に播種し、特に免疫不全の個人で全身感染を引き起こす可能性があります。 サルモネラ 菌と腸上皮との間の相互作用のタイプは、感染の結果を調整します。腸管腔に入ると、 サルモネラ菌 は腸上皮細胞内に侵入して複製します。細胞内レベルでは、サルモ ネラ菌は 、 サルモネラ菌含有液胞(SCV)内の細胞質過剰複製と液胞内低速複製という2つの異なる複製表現型を示す可能性があります。細胞質増殖亢進は、炎症性宿主細胞死および腸内腔への サルモネラ 菌の押し出しを誘発する3;液胞複製は、経上皮浸透と全身広がりをもたらします4。したがって、浸潤および液胞対細胞質複製の程度は、感染の経過に影響を与える。
サルモネラ属は非常に多様であり、異なる宿主範囲と病気を引き起こす能力を持つ何千もの血清型を含みます。たとえば、S です。チフィムリウムは、複数の無関係な宿主に感染するため、ジェネラリスト血清型として定義され、ヒトサルモネラ症の主な原因の1つを表しています。別の言い方をすれば、S。ダービーは、ほとんどが豚から分離されているため、豚に適応した血清型と見なされますが、ヒト感染の原因となる血清型のトップ5にも報告されています1。しかし、上皮細胞内の細菌の挙動に関する知識は、本質的にSとしていくつかの参照株の研究に限定されています。チフィムリウムSL1344は、サルモネラ病原性の広大な自然の多様性を表していません。サルモネラ菌のさまざまな株と上皮細胞との相互作用を特徴付けることは、それらの異なる病原性を理解するのに役立ちます。このため、多数の株の細胞内挙動を迅速かつ大部分自動化された方法で分析するために、ハイスループット蛍光顕微鏡ベースのプロトコルが開発されました。このプロトコルでは、上皮細胞の感染を96ウェルイメージングプレートで行い、自動蛍光顕微鏡を使用して画像取得を行いました。pCHAR-Duoプラスミドを使用して、上皮細胞内のサルモネラ菌の浸潤および複製表現型を蛍光顕微鏡で観察しました5。このプラスミドは、すべての形質転換細菌細胞によって構成的に発現される赤色蛍光レポーターmCherryをコードする遺伝子、および真核細胞の細胞質ゾルにのみ存在しSCVには存在しないグルコース-6-リン酸によって発現が活性化される緑色蛍光レポーターGFPをコードする遺伝子を持っています。したがって、プラスミドは、mCherryおよびGFPレポーターの発現差による液胞および細胞質細菌との間の識別を可能にする。
顕微鏡画像上の液胞および細胞質細菌は、通常、手動スコアリング6によって定量化されますが、これは分析を少数のサンプルに制限する時間のかかる方法です。そこで、自由に利用できる画像解析ソフトウェアであるImageJ7を用いた、領域解析とシングルセル解析の2つの補完的かつ自動化された画像解析が開発されました。エリア解析は、取得した各顕微鏡画像における上皮細胞、赤および緑の サルモネラ 菌が占める領域のデータを使用して、全体的な細胞内細菌負荷と細胞質過剰複製の程度を測定します。この方法は、低倍率で取得した画像に適用できます。そのため、少ない画像で多数の上皮細胞をスコアリングすることができ、取得時間を短縮することができます。シングルセル解析では、細胞セグメンテーションを使用して、感染細胞の割合、平均液胞負荷、および単一細胞分解能で細胞質過剰複製を受けている感染細胞の割合を決定します。
このプロトコルでは、画像解析のすべてのステップが手動で実行されるように詳細に説明されていますが、同じ分析は、特別に設計されたImageJスクリプトによって自動化できます。これらのスクリプトでは、バッチ分析を実行して複数の画像を自動的に分析し、メソッドの実行を高速化することもできます。
サルモネラ菌が腸上皮細胞にコロニーを形成する方法は、感染結果に影響を与えます。浸潤すると、細胞質過剰複製は腸の炎症を誘発しますが3、液胞複製は全身の広がりにつながる可能性があります4。サルモネラ菌株は、腸上皮細胞の内部に侵入および複製する能力が異なる可能性があります9。確かに、サルモネラ菌は2,500以上の血清型からなる非常に多様な属であり、病気を引き起こすさまざまな能力を持っています。さらに、サルモネラ菌は欧州連合で最も頻繁に報告されている食品媒介の発生の原因であり、人口の大きな広がりを示しています1。したがって、サルモネラ菌の細胞内表現型を定量化するための信頼性の高いハイスループットメソッドの利用可能性は、多数のサルモネラ菌株間の病原性の違いを評価し、最終的にこの病原体の正確で株固有のリスク評価を可能にするために非常に重要です。
ここで説明するプロトコルは、上皮細胞内の サルモネラ 菌の挙動を迅速かつ自動化された方法で測定します。上皮細胞の感染は96ウェルイメージングマイクロプレートで行われ、画像取得には自動蛍光顕微鏡が使用されるため、プロトコルはハイスループットアプリケーションに適しています。このプロトコルは、pCHAR-Duoプラスミドを利用しており、2つの蛍光レポーターの発現差を通じて液胞と細胞質 サルモネラ菌 を区別することができます5。 サルモネラ 菌の細胞内表現型は、多くの場合、手動スコアリングによって分析されますが、これは時間のかかる手順であり、多数の菌株や菌株ごとの細胞培養の分析には適さず、オペレーターのエラーやオペレーター間のばらつきが発生しやすいです。これらの制限を克服するために、領域解析とシングルセル解析の2つの補完的で自動化された画像解析が開発されました。無料で入手できるソフトウェアであるImageJを使用して、2つの分析を開発しました。プロトコルの実行を高速化するために、オペレータの介入なしに複数の集録ファイルをバッチ解析するためのImageJスクリプトが補足ファイルとして提供されています。
領域分析は、上皮細胞の核と、GFPと一緒にmCherryまたはmCherryのいずれかを発現する サルモネラ菌 によって特異的に占める領域を測定することにより、上皮細胞の全体的なコロニー形成(感染率)と過剰複製レベル(複製亢進率)を数ステップで定量化するように設計されました。 領域解析は、空胞と高複製 サルモネラ菌 の両方が同じz平面にピントを合わせ、顕微鏡視野ごとに多数の上皮細胞を表示する低倍率で取得した画像に適用され、取得ファイルのサイズと数を削減します。領域分析は、多数のサンプルの自動化された高速かつ軽い分析を可能にするため、スクリーニング実験などのハイスループットアッセイに適しています。
シングルセル解析は、細胞セグメンテーションと細胞面積の測定、および液胞および細胞質ゾルの高複製サルモネラ菌が占める面積の割合を測定することにより、上皮細胞内のサルモネラ菌表現型を単一細胞分解能で定量化するように設計されました。ここでは、領域分析によって特徴付けられた上皮細胞の全体的なコロニー形成を、感染細胞の割合、平均液胞負荷、および高複製率の3つの定量的パラメーターに分解し、各表現型の全体的なコロニー形成への寄与を評価および定量化できるため、領域分析の結果を補完します。シングルセル解析によって提供される詳細度は、画像の取得と解析が遅くなるという犠牲を伴います。実際、シングルセル解像度を達成するために、画像取得は高倍率で行われます。これは、空胞と細胞質の両方のサルモネラ菌に焦点を合わせて観察するために複数のz平面が必要であり、多数の上皮細胞をスコアリングするにはサンプルごとに多数のフィールドを取得する必要があることを意味し、面積分析と比較して取得時間が長くなります。さらに、複数の大きな集録ファイルの解析は計算量が多いため、適切なワークステーションが必要でした(6コア、32 GB RAMワークステーションを使用)。したがって、シングルセル解析は、限られたスループット条件でのスタンドアロンとして、または領域分析と組み合わせて第2レベルの方法として使用して、上皮細胞内のサルモネラ菌表現型をより深く理解することができます。
2つの相補的な解析は、 Sを用いて検証した。Tm、 S.ダービーwt、および S。ダービーΔsipAは、上皮細胞内でのそれらの挙動が浸潤または複製の点で異なることが既に知られていたために選択された9、10。面積および単一細胞分析の結果は、プロトコルが試験された株の特性に従って細胞内 サルモネラ 菌表現型の違いを定量的に区別することを可能にしたことを示している。さらに、これらの結果は、単一細胞解析により、面積解析を使用してスコアリングされた全体的なコロニー形成に対する各細胞内表現型(浸潤、液胞負荷、および細胞質複製)の寄与を定量化できることを示しています。
このプロトコルは、サルモネラ菌のさまざまな株のin vitro病原性を研究するためにここで適用されましたが、上皮細胞内の浸潤および/または複製に関与する遺伝子を特定するためのランダム変異体の研究などの他のアプリケーションを持つことができます。さらに、このプロトコルは、INT407細胞以外の細胞株内のサルモネラ菌の挙動を分析するために適合させることができます。また、他の細胞内微生物の細胞-病原体相互作用を研究するための同様の方法を開発するための出発点としても使用できます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、pCHAR-Duoプラスミドを共有してくれたOlivia Steele-Mortimer博士に感謝したい。この研究は、イタリア保健省の資金提供を受け、PRC2019014およびPRC2021004に助成金を支給しました。
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |