Salmonella envahit et se réplique à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales à la fois dans les vacuoles spécifiques de Salmonella et libres dans le cytosol (hyper-réplication). Un protocole basé sur la microscopie à fluorescence à haut débit est décrit ici pour quantifier les phénotypes intracellulaires de Salmonella par deux analyses d’images complémentaires via ImageJ, atteignant une résolution et un score unicellulaires.
Salmonella est un entéropathogène capable d’envahir l’épithélium intestinal et de se répliquer dans les entérocytes, à la fois à l’intérieur des vacuoles spécifiques de Salmonella et libres dans le cytosol (hyper-réplication cytosolique). Ces différents phénotypes de réplication intracellulaire conduisent à différentes voies de pathogenèse, c’est-à-dire que l’hyper-réplication cytosolique induit la mort cellulaire inflammatoire et l’extrusion dans la lumière intestinale, tandis que la réplication vacuolaire conduit à la pénétration trans-épithéliale et à la propagation systémique. Des efforts importants ont été déployés pour créer des outils de microscopie permettant d’étudier le comportement de Salmonella à l’intérieur des cellules envahies, tels que le plasmide rapporteur de fluorescence pCHAR-Duo qui permet la discrimination entre les bactéries vacuolaires et cytosoliques par expression différentielle de mCherry et GFP. Cependant, les phénotypes intracellulaires sont souvent notés manuellement, une procédure longue qui limite l’analyse à un petit nombre d’échantillons et de cellules. Pour surmonter ces limitations, deux analyses d’images complémentaires et automatisées ont été développées à l’aide d’ImageJ, un logiciel d’analyse d’images disponible gratuitement. Dans le protocole à haut débit, les cellules épithéliales ont été infectées par Salmonella portant pCHAR-Duo en utilisant des plaques à 96 puits. L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé. Ensuite, deux méthodes d’analyse d’images ont été appliquées pour mesurer le comportement intracellulaire de Salmonella à différents niveaux de détail. La première méthode mesure la charge bactérienne intracellulaire globale et l’étendue de l’hyper-réplication cytosolique. Il est rapide et permet la notation d’un grand nombre de cellules et d’échantillons, ce qui le rend approprié pour les tests à haut débit tels que les expériences de criblage. La deuxième méthode effectue une analyse unicellulaire pour déterminer le pourcentage de cellules infectées, la charge vacuolaire moyenne de Salmonella et le taux d’hyper-réplication cytosolique, ce qui donne plus de détails sur le comportement de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales. Les protocoles peuvent être exécutés par des scripts ImageJ spécialement conçus pour exécuter automatiquement des analyses par lots des principales étapes de l’interaction Salmonella-entérocyte.
Salmonella est l’agent bactérien le plus fréquemment signalé à l’origine de foyers de maladies d’origine alimentaire dans l’Union européenne1. La principale manifestation pathologique de l’infection à Salmonella est l’entérite, qui est le résultat du comportement pathogène dans l’intestin après l’ingestion et de la réponse inflammatoire locale qui en résulte2. Cependant, Salmonella peut également se propager aux sites extra-intestinaux et provoquer une infection systémique, en particulier chez les personnes immunodéprimées. Le type d’interaction entre Salmonella et l’épithélium intestinal conditionne l’issue de l’infection. Une fois dans la lumière intestinale, Salmonella envahit et se réplique à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales. Au niveau intracellulaire, Salmonella peut présenter deux phénotypes de réplication différents, l’hyper-réplication cytosolique et la réplication lente intravacuolaire dans les vacuoles contenant Salmonella (SCV). L’hyper-réplication cytosolique induit la mort des cellules hôtes inflammatoires et l’extrusion de Salmonella dans la lumière intestinale3 ; La réplication vacuolaire conduit à une pénétration trans-épithéliale et à une propagation systémique4. Par conséquent, l’étendue de l’invasion et de la réplication vacuolaire par rapport à cytosolique influence l’évolution de l’infection.
Le genre Salmonella est très diversifié, y compris des milliers de sérotypes avec différentes gammes d’hôtes et capacités à causer des maladies. Par exemple, S. Typhimurium est défini comme un sérotype généraliste, car il infecte plusieurs hôtes non apparentés et représente l’une des principales causes de salmonellose humaine. Différemment, S. Le derby est considéré comme un sérotype adapté aux porcs, car il est principalement isolé du porc, mais il est également signalé dans le top cinq des sérovars responsables de l’infection humaine1. Cependant, la connaissance du comportement bactérien à l’intérieur des cellules épithéliales se limite essentiellement à l’étude de quelques souches de référence, comme S. Typhimurium SL1344, qui ne représentent pas la grande diversité naturelle de la pathogénicité de Salmonella . La caractérisation de l’interaction de différentes souches de Salmonella avec les cellules épithéliales contribuerait à comprendre leurs différentes pathogénicités. Pour cette raison, un protocole basé sur la microscopie à fluorescence à haut débit a été développé pour analyser le comportement intracellulaire d’un grand nombre de souches de manière rapide et largement automatisée. Dans ce protocole, l’infection des cellules épithéliales a été réalisée dans des plaques d’imagerie à 96 puits et l’acquisition d’images a été effectuée à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé. Le plasmide pCHAR-Duo a été utilisé pour observer les phénotypes d’invasion et de réplication de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales par microscopie fluorescente5. Ce plasmide porte le gène codant pour le rapporteur fluorescent rouge mCherry, exprimé de manière constitutive par toutes les cellules bactériennes transformées, et le gène codant pour le rapporteur fluorescent vert GFP, dont l’expression est activée par le glucose-6-phosphate présent exclusivement dans le cytosol des cellules eucaryotes et absent dans les SCV. Par conséquent, le plasmide permet la discrimination entre les bactéries vacuolaires et cytosoliques par l’expression différentielle des rapporteurs mCherry et GFP.
Les bactéries vacuolaires et cytosoliques sur les images de microscopie sont généralement quantifiées par notation manuelle6, mais il s’agit d’une méthode longue qui limite l’analyse à un petit nombre d’échantillons. Par conséquent, deux analyses d’images complémentaires et automatisées ont été développées – l’analyse de zone et l’analyse de cellules uniques – à l’aide d’ImageJ7, un logiciel d’analyse d’images disponible gratuitement. L’analyse de la zone mesure la charge bactérienne intracellulaire globale et l’étendue de l’hyper-réplication cytosolique en utilisant les données des zones occupées par les cellules épithéliales, les salmonelles rouges et vertes dans chaque image de microscopie acquise. Cette méthode peut être appliquée aux images acquises à faible grossissement; Par conséquent, il permet de marquer un nombre élevé de cellules épithéliales avec peu d’images, raccourcissant le temps d’acquisition. L’analyse unicellulaire utilise la segmentation cellulaire pour déterminer le pourcentage de cellules infectées, la charge vacuolaire moyenne et le pourcentage de cellules infectées subissant une hyper-réplication cytosolique avec une résolution unicellulaire.
Dans ce protocole, toutes les étapes de l’analyse d’image sont décrites en détail pour être effectuées manuellement, mais la même analyse peut être automatisée par nos scripts ImageJ spécialement conçus. Ces scripts permettent également d’exécuter des analyses par lots pour analyser automatiquement plusieurs images et ainsi accélérer l’exécution de la méthode.
La façon dont Salmonella colonise les cellules épithéliales intestinales influence le résultat de l’infection. Lors de l’invasion, l’hyper-réplication cytosolique induit une inflammation de l’intestin3, tandis que la réplication vacuolaire peut entraîner une propagation systémique4. La capacité des souches de Salmonella à envahir et à se répliquer à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales9 peut varier. En effet, Salmonella est un genre extrêmement diversifié comprenant plus de 2 500 sérovars, qui ont différentes capacités à causer des maladies. En outre, Salmonella est la cause la plus fréquemment signalée de foyers épidémiques d’origine alimentaire dans l’Union européenne, ce qui indique une forte propagation dans la population humaine1. Par conséquent, la disponibilité de méthodes fiables à haut débit pour la quantification des phénotypes intracellulaires de Salmonella est d’une grande importance pour évaluer les différences de virulence entre un grand nombre de souches de Salmonella et, en fin de compte, permettre une évaluation précise et spécifique des risques de cet agent pathogène.
Le protocole décrit ici mesure le comportement de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales de manière rapide et automatisée. L’infection des cellules épithéliales est réalisée dans des microplaques d’imagerie à 96 puits et un microscope à fluorescence automatisé est utilisé pour l’acquisition d’images, ce qui rend le protocole adapté aux applications à haut débit. Ce protocole tire parti du plasmide pCHAR-Duo, qui permet de distinguer les Salmonelles vacuolaires des Salmonelles cytosoliques grâce à l’expression différentielle de deux rapporteurs fluorescents5. Les phénotypes intracellulaires de Salmonella sont souvent analysés par notation manuelle, une procédure longue qui ne convient pas à l’analyse d’un grand nombre de souches et de cultures cellulaires par souche et sujette aux erreurs de l’opérateur et aux variations inter-opérateurs. Pour surmonter ces limitations, deux analyses d’images complémentaires et automatisées ont été développées, l’analyse de zone et l’analyse de cellule unique. ImageJ, un logiciel disponible gratuitement, a été utilisé pour développer les deux analyses. Afin d’accélérer l’exécution du protocole, les scripts ImageJ pour l’analyse par lots de plusieurs fichiers d’acquisition sans intervention de l’opérateur sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires.
L’analyse de surface a été conçue pour quantifier, en quelques étapes, la colonisation globale des cellules épithéliales (taux d’infection) et le niveau d’hyper-réplication (taux d’hyper-réplication) par la mesure des zones spécifiquement occupées par les noyaux des cellules épithéliales et par les salmonelles exprimant mCherry ou mCherry avec la GFP. L’analyse de surface est appliquée aux images acquises à faible grossissement, où les salmonelles vacuolaires et hyper-réplicatives sont focalisées dans le même plan z, et un grand nombre de cellules épithéliales est affiché par champ microscopique, ce qui réduit la taille et le nombre de fichiers d’acquisition. L’analyse de zone permet une analyse automatisée, rapide et légère sur le plan informatique d’un grand nombre d’échantillons, ce qui la rend adaptée aux tests à haut débit tels que les expériences de criblage.
L’analyse unicellulaire a été conçue pour quantifier les phénotypes de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales avec une résolution unicellulaire, obtenue par segmentation cellulaire et mesure de la zone cellulaire et du pourcentage de surface occupée par les Salmonellae hyper-réplicatives vacuolaires et cytosoliques. La colonisation globale des cellules épithéliales caractérisées par l’analyse de l’aire est ici décomposée en trois paramètres quantitatifs, le pourcentage de cellules infectées, la charge vacuolaire moyenne et le taux d’hyper-réplication, permettant d’évaluer et de quantifier la contribution de chaque phénotype à la colonisation globale, complétant ainsi les résultats de l’analyse de surface. Les plus grands détails offerts par l’analyse à cellule unique se font au prix d’une acquisition et d’une analyse d’image plus lentes. En fait, afin d’obtenir une résolution unicellulaire, l’acquisition d’image est effectuée à fort grossissement. Cela implique que plusieurs plans z sont nécessaires pour observer les salmonelles vacuolaires et cytosoliques au point et que l’acquisition d’un grand nombre de champs par échantillon est nécessaire pour marquer un nombre élevé de cellules épithéliales, prolongeant ainsi le temps d’acquisition par rapport à l’analyse de surface. De plus, l’analyse de plusieurs fichiers d’acquisition volumineux est exigeante en termes de calcul, ce qui nécessite un poste de travail approprié (un poste de travail 6 cœurs et 32 Go de RAM a été utilisé). Par conséquent, l’analyse unicellulaire peut être utilisée de manière autonome dans des conditions de débit limité ou comme méthode de deuxième niveau couplée à l’analyse de zone pour mieux comprendre les phénotypes de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales.
Les deux analyses complémentaires ont été validées à l’aide de S. Tm, S. Derby wt, et S. Derby ΔsipA, choisi parce que leur comportement à l’intérieur des cellules épithéliales était déjà connu pour différer en termes d’invasion ou de réplication 9,10. Les résultats des analyses de surface et de cellule unique montrent que le protocole a permis de distinguer quantitativement les différences dans les phénotypes intracellulaires de Salmonella en fonction des caractéristiques des souches testées. De plus, ces résultats démontrent que l’analyse unicellulaire permet de quantifier la contribution de chaque phénotype intracellulaire (invasion, charge vacuolaire et réplication cytosolique) à la colonisation globale notée à l’aide de l’analyse de surface.
Ce protocole a été appliqué ici pour étudier la pathogénicité in vitro de différentes souches de Salmonella, mais il peut avoir d’autres applications telles que l’étude de mutants aléatoires pour identifier les gènes impliqués dans l’invasion et / ou la réplication à l’intérieur des cellules épithéliales. De plus, le protocole peut être adapté pour analyser le comportement de Salmonella à l’intérieur d’autres lignées cellulaires que les cellules INT407. Il peut également être utilisé comme point de départ pour développer des méthodes similaires pour étudier l’interaction cellule-pathogène d’autres micro-organismes intracellulaires.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs aimeraient remercier la Dre Olivia Steele-Mortimer d’avoir partagé le plasmide pCHAR-Duo. Ce travail a été financé par le ministère italien de la Santé, subventions PRC2019014 et PRC2021004.
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |