沙门氏菌在沙门氏菌特异性液泡中和细胞质中游离(超复制)侵入并复制肠上皮细胞内。这里描述了一种基于高通量荧光显微镜的方案,通过 ImageJ 进行两次互补图像分析来量化沙门氏菌的细胞内表型,达到单细胞分辨率和评分。
沙门氏菌是一种肠道病原体,能够侵入肠上皮并在肠细胞中复制,既在沙门氏菌特异性液泡内,又在细胞质中游离(胞质超复制)。这些不同的细胞内复制表型驱动不同的发病途径,即胞质过度复制诱导炎性细胞死亡并挤出到肠腔,而空泡复制导致跨上皮渗透和全身扩散。人们努力创建显微镜工具来研究侵袭细胞内沙门氏菌的行为,例如pCHAR-Duo荧光报告质粒,该质粒允许通过mCherry和GFP的差异表达来区分空泡和胞质细菌。然而,细胞内表型通常是手动评分的,这是一个耗时的过程,将分析限制在少量样品和细胞上。为了克服这些限制,使用免费提供的图像分析软件ImageJ开发了两种互补的自动图像分析。在高通量方案中,使用96孔板感染携带pCHAR-Duo的沙门氏菌上皮细胞。使用自动荧光显微镜进行成像。然后,应用两种图像分析方法测量沙门氏菌在不同细节水平下的细胞内行为。第一种方法测量整体细胞内细菌负荷和胞质超复制的程度。它速度快,可以对大量细胞和样品进行评分,使其适用于高通量测定,例如筛选实验。第二种方法进行单细胞分析以确定感染细胞的百分比,沙门氏菌的平均空泡负荷和胞质超复制率,从而提供有关上皮细胞内沙门氏菌行为的更多详细信息。这些实验方案可以通过专门设计的 ImageJ 脚本来执行,以自动运行沙门氏菌-肠细胞相互作用主要步骤的批量分析。
沙门氏菌是欧盟最常报告的引起食源性疾病暴发的细菌病原体1。沙门氏菌感染的主要病理表现是肠炎,这是摄入后肠道中的病原体行为以及随之而来的局部炎症反应的结果2。然而,沙门氏菌也可以播散到肠外部位并引起全身感染,特别是在免疫功能低下的个体中。沙门氏菌和肠上皮之间的相互作用类型决定了感染的结果。一旦进入肠腔,沙门氏菌就会侵入并在肠上皮细胞内复制。在细胞内水平,沙门氏菌可以呈现两种不同的复制表型,即胞质超复制和含沙门氏菌液泡(SCV)内的液泡内缓慢复制。 胞质超复制诱导炎性宿主细胞死亡和沙门氏菌挤出到肠腔3;液泡复制导致跨上皮渗透和全身扩散4.因此,侵袭程度和液泡与胞质复制影响感染过程。
沙门氏菌属非常多样化,包括数千种具有不同宿主范围和引起疾病能力的血清型。例如,S.鼠伤寒被定义为多面手血清型,因为它感染多种不相关的宿主,并且是人类沙门氏菌病的主要原因之一。不同的是,S.德比被认为是一种适应猪的血清型,因为它主要是从猪中分离出来的,但它也被报道在负责人类感染的前五名血清型中1。然而,关于上皮细胞内细菌行为的知识基本上仅限于研究一些参考菌株,如S。鼠伤寒SL1344,不代表沙门氏菌致病性的巨大自然多样性。表征不同沙门氏菌菌株与上皮细胞的相互作用将有助于了解它们不同的致病性。出于这个原因,开发了一种基于高通量荧光显微镜的方案,以快速且在很大程度上自动化的方式分析大量菌株的细胞内行为。在该协议中,在96孔成像板中进行上皮细胞感染,并使用自动荧光显微镜进行图像采集。使用pCHAR-Duo质粒通过荧光显微镜观察上皮细胞内沙门氏菌的侵袭和复制表型5。该质粒携带编码红色荧光报告基因mCherry的基因,由所有转化的细菌细胞组成表达,以及编码绿色荧光报告基因GFP的基因,其表达被仅存在于真核细胞细胞胞质中的葡萄糖-6-磷酸激活,在SCV中不存在。因此,质粒允许通过mCherry和GFP报告基因的差异表达来区分液泡和胞质细菌。
显微镜图像上的液泡和胞质细菌通常通过手动评分6进行定量,但这是一种耗时的方法,将分析限制在少量样品上。因此,使用免费提供的图像分析软件ImageJ7进行了两种互补的自动图像分析-区域分析和单细胞分析。面积分析通过使用每个获取的显微镜图像中上皮细胞、红色和绿色 沙门氏菌 所占区域的数据来测量总体细胞内细菌负荷和胞质超复制的程度。该方法可应用于以低倍率采集的图像;因此,它允许用很少的图像对大量上皮细胞进行评分,从而缩短采集时间。单细胞分析使用细胞分割来确定感染细胞的百分比、平均液泡负荷以及经历单细胞分辨率的胞质超复制的感染细胞的百分比。
在此协议中,详细描述了图像分析的所有步骤以手动执行,但相同的分析可以通过我们专门设计的 ImageJ 脚本自动执行。这些脚本还允许运行批量分析以自动分析多个图像,从而加快方法的执行速度。
沙门氏菌定植在肠上皮细胞中的方式会影响感染结果。侵袭后,胞质过度复制诱导肠道炎症3,而空泡复制可导致全身扩散4。沙门氏菌菌株在肠道上皮细胞内侵入和复制的能力可能有所不同9.事实上,沙门氏菌是一种极其多样化的属,由 2,500 多种血清型组成,它们具有不同的致病能力。此外,沙门氏菌是欧盟最常报告的食源性暴发原因,表明在人群中大量传播1。因此,提供可靠的高通量方法来定量沙门氏菌的细胞内表型对于评估大量沙门氏菌菌株之间的毒力差异并最终允许对该病原体进行准确和菌株特异性的风险评估非常重要。
这里描述的协议以快速和自动化的方式测量上皮细胞内沙门氏菌的行为。上皮细胞的感染在96孔成像微孔板中进行,并使用自动荧光显微镜进行图像采集,使该方案适用于高通量应用。该协议利用了pCHAR-Duo质粒,它允许通过两个荧光报告基因的差异表达来区分液泡和胞质沙门氏菌5。沙门氏菌的细胞内表型通常通过手动评分进行分析,这是一个耗时的过程,不适合分析大量菌株和每种菌株的细胞培养物,并且容易出现操作员错误和操作员间差异。为了克服这些限制,开发了两种互补和自动图像分析,即面积分析和单细胞分析。ImageJ是一个免费提供的软件,用于开发这两种分析。为了加快协议执行,提供了用于批量分析多个采集文件的 ImageJ 脚本,无需操作员干预。
面积分析旨在通过测量上皮细胞核和表达mCherry或mCherry与GFP一起的 沙门氏菌 特异性占据的区域,在几个步骤中量化上皮细胞的总体定植(感染率)和超复制水平(超复制率)。 面积分析应用于在低放大倍率下采集的图像,其中空泡和超复制 沙门氏菌 在同一z平面上聚焦,并且每个微观视野显示大量上皮细胞,从而减小了采集文件的大小和数量。面积分析允许对大量样品进行自动化、快速和计算轻量级的分析,使其适用于筛选实验等高通量分析。
单细胞分析旨在以单细胞分辨率量化上皮细胞内的沙门氏菌表型,通过细胞分割和测量细胞面积以及液泡和胞质超复制沙门氏菌所占面积的百分比获得。通过面积分析表征的上皮细胞的整体定植在这里分为三个定量参数,感染细胞的百分比,平均空泡负荷和超复制率,允许评估和量化每个表型对整体定植的贡献,因此,补充面积分析的结果。单细胞分析提供的更多细节是以较慢的图像采集和分析为代价的。事实上,为了实现单细胞分辨率,图像采集是在高放大倍率下进行的。这意味着需要多个z平面来观察聚焦的液泡和胞质沙门氏菌,并且每个样品需要采集大量场才能对大量上皮细胞进行评分,从而与面积分析相比延长采集时间。此外,对多个大型采集文件的分析对计算要求很高,因此需要合适的工作站(使用了 6 核 32 GB RAM 工作站)。因此,单细胞分析可以在有限的通量条件下单独使用,也可以作为与面积分析耦合的二级方法,以更深入地了解上皮细胞内的沙门氏菌表型。
使用S验证了两种互补分析的有效性。Tm, S.德比·选择Derby ΔsipA是因为已知它们在上皮细胞内的行为在侵袭或复制方面存在差异9,10。面积和单细胞分析的结果表明,该方案允许根据测试菌株的特征定量区分细胞内沙门氏菌表型的差异。此外,这些结果表明,单细胞分析可以量化每种细胞内表型(侵袭、液泡负荷和胞质复制)对使用面积分析评分的总体定植的贡献。
该协议在这里应用于研究不同沙门氏菌菌株的体外致病性,但它可以有其他应用,例如研究随机突变体以鉴定参与上皮细胞内侵袭和/或复制的基因。此外,该方案可以适用于分析沙门氏菌在INT407细胞以外的其他细胞系内的行为。它也可以作为开发类似方法的起点,用于研究其他细胞内微生物的细胞 – 病原体相互作用。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Olivia Steele-Mortimer博士分享pCHAR-Duo质粒。这项工作由意大利卫生部资助,拨款PRC2019014和PRC2021004。
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |