Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Le membrane cellulari sono sistemi altamente affollati e complessi¹. L’affollamento molecolare può avere un impatto considerevole sulla diffusione di entità legate alla membrana come proteine e lipidi ^2,3,4. Allo stesso modo, le reazioni bimolecolari sulle membrane lipidiche come la dimerizzazione dei recettori o l’oligomerizzazione dei complessi di membrana sono influenzate dall’affollamento ^5,6,7. La natura, la configurazione e la concentrazione dei crowder possono governare il legame di membrana, la diffusività e l’interazione proteina-proteina in diversi modi ^8,9. Poiché controllare l’affollamento delle membrane cellulari e interpretare la sua influenza sulle biomolecole incorporate è impegnativo, i ricercatori hanno cercato di stabilire sistemi alternativi in vitro ¹⁰.

Un approccio popolare per le membrane artificiali affollate è il drogaggio delle membrane a doppio strato con polimeri (come polietilenglicole, PEG) lipidi innestati^11,12. Durante la visualizzazione della dinamica proteica e lipidica su doppi strati lipidici supportati (SLB), questi polimeri schermano ulteriormente i componenti incorporati nella membrana dal substrato sottostante caricato negativamente (come il vetro) sollevando efficacemente il doppio strato lontano dal supporto sottostante. Variando la dimensione e la concentrazione del polimero, è possibile controllare l’estensione dell’affollamento molecolare, nonché la sua separazione dal supporto solido sottostante^13,14. Questo è chiaramente un vantaggio rispetto ai doppi strati lipidici supportati su substrati solidi senza cuscini polimerici^15,16, dove le biomolecole transmembrana possono perdere la loro attività^17,18,19. Ancora più importante, ci permette di ricapitolare l’ambiente affollato della membrana cellulare in vitro, che è fondamentale per molti processi di membrana.

Anche i polimeri innestati superficialmente sulle membrane subiscono cambiamenti nella loro configurazione a seconda della loro densità di innesto¹². A basse concentrazioni, rimangono in una configurazione a spirale entropica, nota come fungo, sopra la superficie della membrana. Con l’aumentare della concentrazione, iniziano a interagire e tendono a srotolarsi ed estendersi, producendo infine una densa formazione simile a una spazzola sulla membrana²¹. Poiché la transizione dal fungo al regime del pennello è altamente eterogenea e si manifesta in condizioni scarsamente caratterizzate del polimero, è importante utilizzare condizioni ben caratterizzate per l’affollamento su membrane innestate in polimero. Rispetto ad un recente studio²⁰, identifichiamo e riportiamo composizioni di membrana affollate che mantengono il trasporto diffusivo e l’attività delle biomolecole transmembrana.

In questo protocollo, discutiamo come generare membrane lipidiche PEGilate e forniamo raccomandazioni per le densità PEG che imitano l’affollamento in due diversi regimi di configurazione polimerica (vale a dire, funghi e spazzole). Il protocollo descrive anche il legame di singole molecole, il tracciamento delle particelle e l’acquisizione e l’analisi dei dati di photobleaching per le molecole incorporate in queste membrane affollate. In primo luogo, descriviamo le fasi di pulizia approfondite, l’assemblaggio della camera di imaging e la generazione di PEG-SLB. In secondo luogo, forniamo dettagli per il legame a singola molecola, il tracciamento delle particelle e gli esperimenti di fotosbiancamento. In terzo luogo, discutiamo i) estraendo le affinità di legame relative, ii) caratterizzando la diffusione molecolare e iii) contando le subunità in un assemblaggio proteico da film di singole molecole sulla membrana.

Mentre abbiamo caratterizzato questo sistema con l’imaging a singola molecola, il protocollo è utile per tutti i biofisici di membrana interessati a comprendere l’effetto dell’affollamento sulle reazioni biomolecolari sulle membrane lipidiche. Nel complesso, presentiamo una solida pipeline per la realizzazione di doppi strati lipidici affollati e supportati, insieme a vari saggi a singola molecola condotti su di essi e le corrispondenti routine di analisi.