Summary

Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano

Published: July 25, 2022
doi:

Summary

Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.

Abstract

A família das caspases é conhecida por mediar muitas vias celulares além da morte celular, incluindo diferenciação celular, pathfinding axonal e proliferação. Desde a identificação da família das proteases de morte celular, tem havido uma busca por ferramentas para identificar e expandir a função de membros específicos da família em estados de desenvolvimento, saúde e doença. No entanto, muitas das ferramentas de caspase atualmente disponíveis comercialmente que são amplamente utilizadas não são específicas para a caspase alvo. Neste relato, delineamos a abordagem que usamos para identificar, validar e direcionar a caspase-9 no sistema nervoso usando um novo inibidor e abordagens genéticas com leituras imuno-histoquímicas. Especificamente, utilizamos o tecido neuronal da retina como modelo para identificar e validar a presença e a função das caspases. Essa abordagem permite o interrogatório de funções específicas da caspase-9 apoptóticas e não apoptóticas do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular, e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.

Introduction

As caspases são uma família de proteases que regulam a morte celular do desenvolvimento, as respostas imunes e a morte celular aberrante na doença 1,2. Embora seja bem sabido que os membros da família da caspase são induzidos em uma variedade de doenças neurodegenerativas, entender qual caspase impulsiona a patologia da doença é mais desafiador3. Tais estudos requerem ferramentas para identificar, caracterizar e validar a função de membros individuais da família caspase. A análise das caspases individuais relevantes é importante tanto do ponto de vista mecanicista quanto terapêutico, pois a literatura possui múltiplos estudos que fornecem evidências dos diversos papéis das caspases 4,5. Assim, se o objetivo é direcionar uma caspase em uma doença para um benefício terapêutico, é fundamental ter um direcionamento específico do(s) membro(s) relevante(s) da família. As técnicas tradicionais para detectar os níveis de caspase no tecido incluem western blotting e abordagens enzimáticas e fluorométricas 3,6. No entanto, nenhuma dessas medidas permite a detecção específica de células dos níveis de caspase e, em alguns cenários, as caspases clivadas muitas vezes não podem ser detectadas pelas medidas tradicionais de análise de proteínas. Sabe-se que as caspases podem desempenhar diferentes papéis apoptóticos e não apoptóticos no mesmo tecido7, portanto, é necessária uma caracterização cuidadosa dos níveis de caspase específicos das células para a compreensão precisa das vias de desenvolvimento e da doença.

Este estudo mostra a ativação e a função da caspase em um modelo de hipóxia-isquemia neurovascular – oclusão da veia retiniana (RVO)7,8. Em um tecido complexo como a retina, existem vários tipos de células que podem ser afetadas pela hipóxia-isquemia induzida no RVO, incluindo células gliais, neurônios e vasculatura7. Na retina adulta de camundongos, há muito pouca expressão de caspases evidentes no tecido saudável, medida pela imuno-histoquímica (IHC)7, mas esse não é o caso durante o desenvolvimento9 ou em modelos de doença retiniana10,11. A IHC é uma técnica bem estabelecida na pesquisa biomédica e tem permitido a validação de alvos patológicos e patológicos, a identificação de novos papéis por meio da localização espacial e a quantificação de proteínas. Nos casos em que os produtos de caspase clivada não podem ser detectados por western blot ou análise fluorométrica, nem a localização celular específica de caspases distintas ou interrogação de vias de sinalização de caspase através da localização, então o IHC deve ser usado.

Para determinar a(s) caspase(s) funcionalmente relevante na RVO, a IHC foi utilizada com anticorpos validados para caspases e marcadores celulares. Os estudos prévios realizados em laboratório mostraram que a caspase-9 foi rapidamente ativada em um modelo de acidente vascular cerebral isquêmico e inibição da caspase-9 com um inibidor altamente específico protegido da disfunção neuronal e da morte12. Como a retina faz parte do sistema nervoso central (SNC), ela serve como um sistema modelo para consultar e investigar melhor o papel da caspase-9 em lesões neurovasculares13. Para este fim, o modelo de RVO em camundongo foi usado para estudar a localização e distribuição específicas da célula da caspase-9 e sua implicação na lesão neurovascular. A RVO é uma causa comum de cegueira em adultos em idade ativa que resulta de lesão vascular14. Verificou-se que a caspase-9 foi expressa de forma não apoptótica em células endoteliais, mas não em neurônios.

Como tecido, a retina tem a vantagem de ser visualizada como uma montagem plana, que permite a apreciação das redes vasculares, ou como seções transversais, que destacam as camadas neuronais da retina. A quantificação da expressão da proteína caspase em cortes transversais fornece contexto, em relação ao qual a caspase é potencialmente crítica na conectividade neuronal da retina e na função da visão, identificando a localização da(s) caspase(s) na retina. Após a identificação e validação, o direcionamento da caspase de interesse é alcançado usando a deleção específica de células induzíveis da caspase identificada. Para possíveis investigações terapêuticas, a relevância das caspases de interesse foi testada usando ferramentas específicas para inibir a caspase ativada. Para a caspase-9 uma célula persignificava inibidor altamente seletivo 7,15, Pen1-XBIR3 foi utilizada. Para este relato, foram utilizadas cepas C57BL/6J masculinas de 2 meses de idade e knockout endotelial induzível por tamoxifeno caspase-9 (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J. Esses animais foram expostos ao modelo de camundongo de RVO e C57BL/6J foram tratados com o inibidor seletivo da caspase-9, Pen1-XBir3. A metodologia descrita pode ser aplicada a outros modelos de doença nos sistemas central e periférico 7,15.

Protocol

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia. 1. Preparação do tecido retiniano e criossecção Eutanasiar os animais por meio de anestesia intraperitoneal (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e pe…

Representative Results

O protocolo descrito permite ao usuário analisar e quantificar os níveis de caspase-9 no tecido da retina. Além disso, apresenta ferramentas para identificar, validar e direcionar especificamente a caspase-9 e os substratos a jusante. As etapas resumidas permitem a análise quantificável dos níveis de caspase e da especificidade celular em fotomicrografias fluorescentes. Todas as figuras mostram fotomicrografias representativas e quantificação dos níveis de caspase indicados na retina total, células endoteliais …

Discussion

As caspases são uma família de proteases com vários membros melhor estudada por seus papéis na morte celular e inflamação; no entanto, mais recentemente, uma variedade de funções de não-morte tem sido descoberta para alguns membros da família 4,5. Grande parte da nossa compreensão da função da caspase é derivada do trabalho em cultura de células e de dados inferenciais de doenças humanas. Embora seja apreciado que haja indução, ativação ou ina…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE – 1644869 e pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) dos National Institutes of Health (NIH), número de prêmio F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT), e o Departamento de Defesa do Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).

Materials

anti-Caspase-7 488 Novus Biologicals NB-56529AF488 use at 1:150
anti-cl-Caspase-9 Cell Signaling 9505-S use at 1:800
anti-CD31 BD Pharmingen 553370 use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope Biovision
FIJI 2.3.0 open source
Fluormount G Fisher 50-187-88
Forcep Roboz RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice lab generated see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649) Vector DL-1207 use at 1:200
Ketamine Hydrochloride Henry Schein NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump  Masterflex
Pen1-XBir3 lab generated see Avrutsky 2020
Prism 9.1 GraphPad
Tissue-Tek O.C.T. Fisher 14-373-65
Vis-a-View 4.0 Visitron Systems
Xylazine Akorn NDCL 59399-110-20

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Citer Cet Article
Colón Ortiz, C. K., Potenski, A. M., Johnson, K. V., Chen, C. W., Snipas, S. J., Jean, Y. Y., Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Quantification of Immunostained Caspase-9 in Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (185), e64237, doi:10.3791/64237 (2022).

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