Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein γ-Herpesvirus, das auch als humanes Herpesvirus Typ 4 bekannt ist, ist in der menschlichen Bevölkerung allgegenwärtig und etabliert eine lebenslange latente Infektion bei mehr als 90% der erwachsenen Bevölkerung¹. Die meisten EBV-Primärinfektionen treten im Kindes- und Jugendalter auf, wobei sich ein Teil der Patienten mit infektiöser Mononukleose (IM)² manifestiert und eine charakteristische Immunpathologie aufweist, einschließlich einer aktivierten Immunantwort mit CD8⁺ T-Zellen im Blut und einer vorübergehenden Proliferation von EBV-infizierten B-Zellen im Oropharynx³. Der Verlauf der IM kann 2-6 Wochen dauern und die Mehrheit der Patienten erholt sich gut⁴. Einige Personen entwickeln jedoch persistierende oder wiederkehrende IM-ähnliche Symptome mit hoher Morbidität und Mortalität, die als chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV) eingestuft ^wird5. Darüber hinaus ist EBV ein wichtiges onkogenes Virus, das eng mit einer Vielzahl von Malignomen verwandt ist, darunter epithelioide und lymphatische Malignome wie Nasopharynxkarzinom, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom (HL) und T/NK-Zell-Lymphom⁶. Obwohl EBV seit über 50 Jahren untersucht wird, sind seine Pathogenese und der Mechanismus, durch den es die Proliferation von Lymphozyten induziert, nicht vollständig aufgeklärt.

Mehrere Studien haben die molekularen Signaturen für die Immunpathologie der EBV-Infektion durch Transkriptomsequenzierung untersucht. Zhong et al. analysierten das Whole-Transkriptom-Profiling von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chinesischen Kindern mit IM oder CAEBV, um festzustellen, dass CD8+ T-Zellexpansion überwiegend in der IM-Gruppe⁷ gefunden wurde, was darauf hindeutet, dass CD8⁺ T-Zellen eine wichtige Rolle bei IM spielen könnten. In ähnlicher Weise fand eine andere Studie niedrigere Anteile an EBV-spezifischen zytotoxischen T- und CD19+ B-Zellen und höhere Prozentsätze von CD8⁺ T-Zellen bei Patienten mit IM, die durch eine primäre EBV-Infektion verursacht wurden, als bei Patienten mit IM, die sowohl durch EBV-Reaktivierung als auch durch andere Wirkstoffe verursacht wurden⁸. B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Al Tabaa et al. fanden heraus, dass B-Zellen während IM⁹ polyklonisch aktiviert und in Plasmablasten (CD19+, CD27+ und CD20− sowie CD138⁻-Zellen) und Plasmazellen (CD19+, CD27+ und CD20⁻ und CD138⁺) differenziert wurden. Darüber hinaus fanden Zhong et al. heraus, dass die Monozytenmarker CD14 und CD64 bei CAEBV hochreguliert waren, was darauf hindeutet, dass Monozyten eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort von CAEBV durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und hyperaktive Phagozytose spielen könnten⁷. Alka et al. charakterisierten das Transkriptom von MACS sortierten CD56^dim CD16⁺ NK-Zellen von vier Patienten von IM oder HL und fanden heraus, dass NK-Zellen sowohl aus IM als auch aus HL eine herunterregulierte angeborene Immunität und Chemokin-Signalgene aufwiesen, die für die Hyporeagibilität von NK-Zellen verantwortlich sein könnten¹⁰. Darüber hinaus analysierten Greenough et al. die Genexpression von sortierten CD8⁺ T-Zellen von 10 PBMCs von Personen mit IM. Sie berichteten, dass ein großer Teil der CD8⁺ T-Zellen in IM virusspezifisch war, aktiviert, sich teilte und darauf vorbereitet war, Effektoraktivitäten auszuüben¹¹. Sowohl T-Zell-vermittelte, EBV-spezifische Reaktionen als auch NK-Zell-vermittelte, unspezifische Reaktionen spielen eine wesentliche Rolle während der primären EBV-Infektion. Diese Studien untersuchten jedoch nur die Transkriptomergebnisse der vielfältigen Mischung von Immunzellen oder nur eine bestimmte Subpopulation von Lymphozyten, was für den umfassenden Vergleich der molekularen Eigenschaften und Funktionen verschiedener Immunzellsubpopulationen bei Kindern mit IM im gleichen Krankheitszustand nicht ausreicht.

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen von PBMCs (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszenzmarkierte Zellen mit einem Magnetabscheider und FACS gereinigt oder mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. RNA kann aus den gereinigten Zellen für die Transkriptomsequenzierung extrahiert werden. Diese Methode wird die Charakterisierung und Genexpression verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis der Immunpathologie der EBV-Infektion erweitern wird.