Separazione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni di sangue periferico da bambini con mononucleosi infettiva

Il virus di Epstein-Barr (EBV), un γ-herpesvirus noto anche come herpes virus umano di tipo 4, è onnipresente nella popolazione umana e stabilisce un’infezione latente permanente in oltre il 90% della popolazione adulta¹. La maggior parte dell’infezione primaria da EBV si verifica durante l’infanzia e l’adolescenza, con una frazione di pazienti che manifesta mononucleosi infettiva (IM)², che mostra immunopatologia caratteristica, tra cui una risposta immunitaria attivata con cellule T CD8⁺ nel sangue e una proliferazione transitoria di cellule B infette da EBV nell’orofaringe³. Il decorso della IM può durare 2-6 settimane e la maggior parte dei pazienti guarisce ben⁴. Tuttavia, alcuni individui sviluppano sintomi IM-simili persistenti o ricorrenti con elevata morbilità e mortalità, che è classificata come infezione cronica attiva da EBV (CAEBV)⁵. Inoltre, l’EBV è un importante virus oncogeno, che è strettamente correlato a una varietà di tumori maligni, tra cui tumori maligni epitelioidi e linfoidi come il carcinoma nasofaringeo, il linfoma di Burkitt, il linfoma di Hodgkin (HL) e il linfoma a cellule T / NK⁶. Sebbene l’EBV sia stato studiato per oltre 50 anni, la sua patogenesi e il meccanismo con cui induce la proliferazione dei linfociti non sono stati completamente chiariti.

Diversi studi hanno studiato le firme molecolari per l’immunopatologia dell’infezione da EBV mediante sequenziamento del trascrittoma. Zhong et al. hanno analizzato il profilo dell’intero trascrittoma delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di bambini cinesi con IM o CAEBV per scoprire che l’espansione delle cellule T CD8 + è stata trovata prevalentemente nel gruppo IM⁷, suggerendo che le cellule T CD8 ⁺ possono svolgere un ruolo importante nella IM. Allo stesso modo, un altro studio ha rilevato percentuali più basse di cellule T citotossiche e ^CD19+ B specifiche per EBV e percentuali più elevate di cellule T CD8⁺ nei pazienti con IM causata da infezione primaria da EBV rispetto ai pazienti con IM causata sia dalla riattivazione dell’EBV che da altri agenti⁸. Le cellule B sono coinvolte per la prima volta nell’IM perché i recettori EBV sono presentati sulla loro superficie. Al Tabaa et al. hanno scoperto che le cellule B erano attivate policlonalmente e differenziate in plasmablasti (cellule CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmacellule (CD19+, CD27+ e CD20⁻ e CD138⁺) durante IM⁹. Inoltre, Zhong et al. hanno scoperto che i marcatori monocitari CD14 e CD64 erano sovraregolati in CAEBV, suggerendo che i monociti possono svolgere un ruolo importante nella risposta immunitaria cellulare di CAEBV attraverso citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) e fagocitosi iperattiva⁷. Alka et al. hanno caratterizzato il trascrittoma delle cellule NK CD56 CD56 ^{CD16+ selezionate} da quattro pazienti di IM o HL e hanno scoperto che le cellule NK di IM e HL avevano una sottoregolazione dell’immunità innata e dei geni di segnalazione delle chemochine, che potrebbero essere responsabili dell’iporeattività delle cellule NK¹⁰. Inoltre, Greenough et al. hanno analizzato l’espressione genica delle cellule T CD8 ⁺ ordinate da 10 PBMC di individui con IM. Hanno riferito che una grande percentuale di cellule T CD8 ⁺ in IM erano specifiche del virus, attivate, divise e innescate per esercitare attività effettrici¹¹. Sia le risposte mediate dalle cellule T, specifiche per l’EBV, sia le risposte non specifiche mediate dalle cellule NK svolgono un ruolo essenziale durante l’infezione primaria da EBV. Tuttavia, questi studi hanno studiato solo i risultati del trascrittoma della diversa miscela di cellule immunitarie o solo una certa sottopopolazione di linfociti, il che non è sufficiente per il confronto completo delle caratteristiche molecolari e delle funzioni di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie nei bambini con IM allo stesso stato di malattia.

Questo articolo descrive un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule immunitarie di PBMC (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 ⁺, cellule B e cellule NK). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate utilizzando un separatore magnetico e FACS o analizzate mediante citometria a flusso. L’RNA può essere estratto dalle cellule purificate per il sequenziamento del trascrittoma. Questo metodo consentirà la caratterizzazione e l’espressione genica di diverse cellule immunitarie negli stessi stati di malattia di individui con IM, che amplierà la nostra comprensione dell’immunopatologia dell’infezione da EBV.