Isolering och direkt neuronal omprogrammering av musastrocyter
Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att generera högt berikade kulturer av astrocyter härledda från olika regioner i centrala nervsystemet hos postnatala möss och deras direkta omvandling till funktionella neuroner genom tvångsuttryck av transkriptionsfaktorer.
Abstract
Direkt neuronal omprogrammering är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att generera funktionella neuroner från olika startcellpopulationer utan att passera genom multipotenta intermediärer. Denna teknik har inte bara stora löften inom sjukdomsmodellering, eftersom det gör det möjligt att konvertera till exempel fibroblaster för patienter som lider av neurodegenerativa sjukdomar till neuroner, men representerar också ett lovande alternativ för cellbaserade ersättningsterapier. I detta sammanhang var ett stort vetenskapligt genombrott demonstrationen att differentierade icke-neurala celler i centrala nervsystemet, såsom astrocyter, kunde omvandlas till funktionella neuroner in vitro. Sedan dess har direkt omprogrammering av astrocyter in vitro till nervceller gett betydande insikter om de molekylära mekanismerna bakom tvångsidentitetsomvandling och de hinder som förhindrar effektiv omprogrammering. Resultat från in vitro-experiment utförda i olika laboratorier är dock svåra att jämföra på grund av skillnader i de metoder som används för att isolera, odla och omprogrammera astrocyter. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att på ett tillförlitligt sätt isolera och odla astrocyter med hög renhet från olika regioner i centrala nervsystemet hos möss vid postnatala åldrar via magnetisk cellsortering. Dessutom tillhandahåller vi protokoll för att omprogrammera odlade astrocyter till nervceller via viral transduktion eller DNA-transfektion. Detta strömlinjeformade och standardiserade protokoll kan användas för att undersöka de molekylära mekanismerna som ligger till grund för underhåll av cellidentitet, upprättandet av en ny neuronal identitet, samt genereringen av specifika neuronala subtyper och deras funktionella egenskaper.
Introduction
Däggdjurets centrala nervsystem (CNS) är mycket komplext och består av hundratals olika celltyper, inklusive ett stort antal olika neuronala subtyper 1,2,3,4,5,6. Till skillnad från andra organ eller vävnader 7,8,9 har däggdjurets CNS en mycket begränsad regenerativ kapacitet; neuronal förlust efter traumatisk hjärnskada eller neurodegeneration är irreversibel och resulterar ofta i motoriska och kognitiva underskott10. I syfte att rädda hjärnfunktioner är olika strategier för att ersätta förlorade nervceller under intensiv utredning11. Bland dem framträder direkt omprogrammering av somatiska celler till funktionella neuroner som ett lovande terapeutiskt tillvägagångssätt12. Direkt omprogrammering, eller transdifferentiering, är processen att konvertera en differentierad celltyp till en ny identitet utan att passera genom ett mellanliggande proliferativt eller pluripotent tillstånd 13,14,15,16. Banbrytande genom identifieringen av MyoD1 som en faktor som är tillräcklig för att omvandla fibroblaster till muskelceller17,18, har denna metod framgångsrikt tillämpats för att omprogrammera flera celltyper till funktionella neuroner 19,20,21.
Astrocyter, den vanligaste makroglian i CNS22,23, är en särskilt lovande celltyp för direkt neuronal omprogrammering av flera skäl. För det första är de brett och jämnt fördelade över CNS, vilket ger en riklig loco-källa för nya neuroner. För det andra är astrocyter och neuroner utvecklingsmässigt nära besläktade, eftersom de delar en gemensam förfader under embryonal utveckling, de radiella glialcellerna24. Det gemensamma embryonala ursprunget för de två celltyperna verkar underlätta neuronal omvandling jämfört med omprogrammering av celler från olika bakterielager19,21. Dessutom upprätthålls mönstringsinformation som ärvts av astrocyter genom deras radiella glia-ursprung också i vuxna astrocyter 25,26,27 och verkar bidra till genereringen av regionalt lämpliga neuronala subtyper 28,29,30. Därför är undersökning och förståelse av omvandlingen av astrocyter till neuroner en viktig del av att uppnå den fulla potentialen för denna teknik för cellbaserade ersättningsstrategier.
Omvandlingen av in vitro-odlade astrocyter till neuroner har lett till flera genombrott inom området direkt neuronal omprogrammering, inklusive: i) identifiering av transkriptionsfaktorer som är tillräckliga för att generera neuroner från astrocyter 15,19,31, ii) upplösning av molekylära mekanismer som utlöses av olika omprogrammeringsfaktorer i samma cellulära sammanhang 32 , och iii) belysa effekten av astrocyternas utvecklingsmässiga ursprung på inducering av olika neuronala subtyper 28,29,33. Dessutom avslöjade direkt omvandling av astrocyter in vitro flera stora hinder som begränsar direkt neuronal omprogrammering34,35, såsom ökad produktion av reaktiva syrearter (ROS)34 och skillnader mellan mitokondriellt proteom av astrocyter och neuroner35. Därför stöder dessa observationer starkt användningen av primära kulturer av astrocyter som en modell för direkt neuronal omprogrammering för att undersöka flera grundläggande frågor i biologi12, relaterade till cellidentitetsunderhåll, vägspärrar som förhindrar cell ödesförändringar, samt metabolismens roll i omprogrammering.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att isolera astrocyter från möss vid postnatal (P) ålder med mycket hög renhet, vilket demonstreras genom att isolera astrocyter från den murina ryggmärgen29. Vi tillhandahåller också protokoll för att omprogrammera astrocyter till nervceller via viral transduktion eller DNA-plasmidtransfektion. Omprogrammerade celler kan analyseras vid 7 dagar efter transduktion (7 DPT) för att bedöma olika aspekter, såsom omprogrammeringseffektivitet och neuronal morfologi, eller kan bibehållas i odling i flera veckor för att bedöma deras mognad över tid. Viktigt är att detta protokoll inte är specifikt för ryggmärgsastrocyter och kan lätt appliceras för att isolera astrocyter från olika andra hjärnregioner, inklusive kortikal grå substans, mellanhjärna och cerebellum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primära kulturer av murina astrocyter är ett anmärkningsvärt in vitro-modellsystem för att studera direkt neuronal omprogrammering. Faktum är att trots att de isoleras i ett postnatalt stadium uttrycker celler typiska astrocytmarkörer29, behåller uttrycket av mönstringsgener 28,29 och upprätthåller förmågan att föröka sig, liknande in vivo-astrocyter vid en jämförbar ålder38. Efte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Ines Mühlhahn för kloning av konstruktionerna för omprogrammering, Paulina Chlebik för viral produktion och Magdalena Götz och Judith Fischer-Sternjak för kommentarer till manuskriptet.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
References
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014 (2020).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
- Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6 (2018).
- Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration – a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
- Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29 (2017).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
- Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
- Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373 (2010).
- Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
- Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
- Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697 (2017).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220 (2020).
- Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
- Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532 (2021).
- Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
- Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409 (2021).
- Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
- Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
- Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
- Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
- Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
- Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
- Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
- Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
- Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
- Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).
