该协议详细介绍了从胎儿肠道组织建立肠样,一种三维肠道模型。上皮生物标志物的免疫荧光成像用于模型表征。脂多糖(一种细菌内毒素)的顶端暴露,使用显微注射技术以剂量依赖性方式诱导上皮通透性,通过荧光葡聚糖的泄漏来测量。
人类胎儿组织来源的类肠正在成为研究早产儿肠道损伤的有前途的 体外 模型。肠样肠表现出极性,包括具有顶端边界的管腔、紧密的连接和暴露于生长培养基的基底外层。肠道损伤的后果包括粘膜炎症和通透性增加。在脆弱的早产儿受试者中检测肠道通透性通常是不可行的。因此,需要一个 体外 胎儿组织来源的肠道模型来研究早产儿的肠道损伤。肠样可用于测试由紧密连接蛋白调节的上皮通透性的变化。在肠样细胞中,肠道干细胞分化成所有上皮细胞类型,并在小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜基质上形成三维结构。在本文中,我们描述了用于从胎儿肠道组织建立肠样蛋白的方法,用免疫荧光成像表征肠紧密连接蛋白,并测试上皮通透性。由于革兰氏阴性显性细菌生态失调是肠损伤的已知危险因素,我们使用脂多糖(LPS),一种由革兰氏阴性细菌产生的内毒素,来诱导肠通透性。将荧光素标记的葡聚糖显微注射到肠腔中,并测量泄漏到培养基中的系列葡聚糖浓度以量化细胞旁通透性的变化。实验表明,顶端暴露于LPS以浓度依赖性方式诱导上皮通透性。这些发现支持革兰氏阴性显性遗传失调有助于早产儿肠道损伤机制的假设。
早产儿暴露于频繁和长期的炎症中,这使他们面临肠道损伤的风险增加,导致长期残疾或死亡1。这一领域的研究受到对脆弱早产儿进行实验的能力有限的挑战。此外,缺乏合适的模型阻碍了对早产肠道环境的全面研究2。现有的体外和体内模型都未能全面代表人类早产肠道环境。具体来说,单个上皮胎儿细胞系可能不会形成紧密的连接,并且动物模型表现出与人类早产儿不同的炎症和免疫反应。随着Wnt信号传导作为肠隐窝干细胞和新型Lgr5+组织干细胞增殖和分化的主要途径的发现,肠组织来源的类器官(如肠类和结肠类)被建立为体外模型3,4,5。使用这项技术,可以创建和利用从整个组织或肠道活检开发的三维(3D)肠样模型来研究上皮对肠道环境的反应6,7。
与培养物中生长的典型肠道细胞系相比,类肠表现出极性,其腔由紧密连接蛋白连接8。这允许暴露于生长培养基中的基底外侧边界,以及腔内显微注射以评估顶端边界。此外,类肠表现出与人类上皮相似的遗传、生理和免疫特征9,10。胎儿组织来源的类肠可以检查早产儿对上皮功能的作用。类肠的独特特征可以更接近早产肠道环境9。组织来源的肠样蛋白可用于测试单层形式的紧密连接完整性或嵌入固化基底膜蛋白混合物中的 3D 结构。如果需要顶端暴露,后一种形式需要显微注射技术。肠样模型中上皮反应的测量包括通过RNA测序进行基因表达,通过酶联免疫测定(ELISA)或高级成像技术进行生物标志物。这里介绍的技术为使用荧光测定法测量总通透性提供了另一种可行的选择。
早产儿肠道损伤具有多因素发病机制,包括肠道微生物群落失衡。类肠可以为研究早产肠道疾病的某些方面提供极好的模型,例如涉及上皮功能的坏死性小肠结肠炎11。肠样蛋白表现出与人胎儿肠道相似的特征10。将肠样暴露在培养基中的脂多糖(LPS)(一种由革兰氏阴性菌产生的内毒素)中,作为基底外侧暴露诱导基因表达,从而导致炎症和肠道通透性增加7。本研究旨在评估顶端暴露于LPS等细菌产物后上皮通透性的总体变化。研究结果可能为肠道损伤发病机制中涉及的微生物-上皮相互作用提供见解。用于测试总渗透性的方法需要显微注射装置和技能。
该协议详细介绍了胎儿肠道组织中肠样的建立,以及免疫荧光染色和上皮通透性测试的模型表征。使用显微注射技术和培养基中泄漏的葡聚糖-FITC浓度的连续时程测量测试肠的通透性。该方案的新颖之处在于,与培养基中的基底外侧暴露相比,顶端暴露更接近人类肠道生理学7。在以前的研究中,Hill等人利用连续成像和随时间推移的荧光强度计算16。Ares等人将上皮模型的基底外侧膜暴露于LPS,然后比较细胞基因表达模式7。相比之下,我们使用测试试剂的顶点暴露,然后通过测量培养基中泄漏的葡聚糖的连续浓度来检查总渗透性的潜在变化。我们的方法还允许通过收集细胞mRNA对培养基中上皮细胞产生的细胞因子和基因表达进行连续比较分析。LPS因其诱导通透性和炎症的能力而常用于研究动物和 体外 模型中的肠道损伤7,17。当在该模型中测试LPS时,上皮通透性通过暴露浓度来区分。该协议可以扩展到使用不同的显微注射材料和结果测量来研究其他疾病病理。
该方案中的关键步骤包括从胎儿肠道组织建立肠样、肠样表征和显微注射技术。这项研究的完整性取决于准确的细胞采样。使用解剖标志和血管有助于确保小肠细胞的选择。由于胎儿肠道干细胞的生长和分化健壮,因此不需要从其他上皮细胞中分离干细胞的广泛程序。建立肠样蛋白后,通过蛋白质和细胞标志物染色来确认模型的特征非常重要。在该协议中,使用绒毛和CDX2对肠细胞,使用溶菌酶对Paneth细胞和使用粘蛋白对杯状细胞进行肠细胞染色,所有细胞均在小肠上皮18,19,20内发现。与显示一种细胞类型的传统单细胞系相比,类肠从肠道祖细胞中建立所有细胞类型8。该协议的染色部分可以针对感兴趣的特定细胞标志物进行修改。对于该协议的可靠性至关重要的是显微注射技术。通过使用葡聚糖-FITC溶液测量每个泵的体积并在显微镜下可视化吸头的直径,可以验证微量移液器吸头的一致性。由于存在污染风险,同一微量移液器不能用于多次暴露。此外,肠样的形状和生长会受到其生长培养基内容物的影响。我们发现球形而不是花椰菜形肠为显微注射提供了更好的模型。球形可以由介质中更大的Wnt因子诱导21。
该协议在很大程度上取决于执行者在显微注射方面的技能,以减少变化,特别是在时间敏感的测量中。通过让具有相同经验的执行者具有一致的技术,使用相同的细胞来源以避免遗传变异,在同一通道进行测试以消除成熟偏差,以及在同一类型的培养基中培养细胞以进行相似的细胞分化,可以最大限度地减少变异。生长培养基的组分可能在 体外 而不是 体内 环境中诱导干细胞的不同分化。例如, 在体内,溶菌酶直到妊娠发育的第22-24周才表达,此时潘氏细胞形成并变得有功能22。然而,我们能够在从10周胎儿肠道建立的肠中检测到溶菌酶。由于显微注射所需的高技术技能,这种方法可以限制一次测试的曝光次数。微量注射穿刺孔的葡聚糖泄漏会影响渗透性的评估。为了消除这种影响,建议在显微注射后立即进行三次洗涤,以去除手术中残留的葡聚糖。显微注射后4-6小时应每小时测量培养基中的葡聚糖浓度。注射后2-4小时内右旋糖酐浓度显着升高的实验应从最终分析中排除。
这种方法有几个优点。与Transwell上的肠源性单层相比,它需要更低的成本和资源。此外,它可以扩展到其他暴露,如活细菌或病毒,以研究肠道微生物和上皮之间的初始相互作用。肠样的封闭腔可以保持显微注射活细菌的稳定生长,而不会污染生长培养基13。与暴露于生长培养基和孵育氧气的单层不同,封闭的腔是一个紧密、孤立的空间。封闭的管腔允许不与生长培养基通信,并且随着活细菌生长,管腔氧含量随着时间的推移而降低13。
与成人肠道干细胞或动物模型相比,使用胎儿肠道组织更准确地描绘了早产儿的肠上皮7。此外,肠样的极性允许顶端和基底外侧暴露和测量23。肠形成具有较低氧合浓度的封闭腔,其更接近于模拟肠道的氧合浓度24。与技术更先进的协议16相比,使用粗大介质测量可以提高该技术的可访问性。实验表明,LPS的顶端暴露可诱发上皮渗漏,且具有浓度依赖性。由于该方法检查右旋糖酐泄漏浓度的变化,因此可用于检测紧密连接处的粗大功能变化。暴露肠的信使RNA收集和测序以及蛋白质印迹分析可以补充对大体功能变化的分析。该模型研究与早产环境高度相似的系统中的肠上皮完整性,因此可用于更好地了解早产肠损伤和其他疾病病理。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Ian Glass博士和华盛顿大学出生缺陷研究实验室的工作人员分享胎儿组织。我们还要感谢密歇根大学转化组织建模实验室的Michael Dame博士和Jason Spence博士在整个过程中给予的无尽支持和指导。
Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1×0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
Petri Dishes, 35×10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
Petri Dishes, 60×15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
Primocin 50 mg/mL, 10×1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
Wall air supply | N/A | N/A | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |