胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

ヒト組織採取は、ワシントン大学治験審査委員会(研究ID:STUDY380およびCR ID:CR3603)によって承認され、先天性欠損症研究所によって実施されました。先天性欠損症研究所は、ユーニスケネディシュライバー国立小児保健人間発達研究所からのNIH賞番号5R24HD000836によってサポートされました。検体は同意した参加者から収集され、匿名化された状態で健康情報なしで送信されました。小腸検体は、氷冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に保存され、一晩受入検査室に郵送されました。 1. 試薬調製 注:試薬とカタログ番号のリストについては、 材料表 を参照してください。推奨容量は、特に明記されていない限り、6ウェルプレート用です。 50 mgのBSA粉末を50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に100 μg/mLの広域抗生物質プリモシンを溶解して0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を調製し、組織またはエンテロイドと接触するすべてのプラスチック製品およびチップをコーティングします。BSAでコーティングするには、ろ過されていないピペットチップを、チップを覆うのに十分なBSAを含む50 mLコニカルチューブに入れるか、ペトリ皿の表面を覆うために1〜2 mLのBSAを追加するか、使用前に室温で少なくとも20〜30分間、15 mLのコニカルチューブにBSAを充填します。 50 mLのDPBSを100 μg/mLのプリモシンおよび50 μg/mLのゲンタマイシンと混合して、DPBS培地を調製します。この培地は、2.5 μg/mL アムホテリシンの有無にかかわらず調製してください。 2 mLのオルガノイド増殖培地、100 μg/mLのプリモシン、10 μM Y27632、および2.5 μM CHIR99021を混合して、腸様増殖培地を調製します。毎日新鮮な培地を作り、37°Cの細胞培養インキュベーターで温めます。注:Y27632の希釈係数は1:250です。CHIR99021の場合、CHIRストック溶液を温かい培地で1:100に希釈し、次に腸内増殖培地で1:40に希釈して、1:4000に希釈します。 ストックの基底膜マトリックス10 μM Y27632および2.5 μM CHIR99021を添加して、基底膜マトリックスミックスを調製します。6ウェルプレートの1ウェルに対して、8 mg/mLのタンパク質濃度で合計285 μLの最終基底膜マトリックスミックスを作成します。注:基底膜マトリックスは、液体の形を保つために氷のように冷たくする必要があり、より暖かい温度で固化します。ストック基底膜マトリックスのタンパク質濃度は、次の式を使用して8 mg/mLの最終タンパク質濃度を作成するのに必要な量を決定します。ボリューム 1 ×濃度 1 = ボリューム 2 × 濃度 2 PBS中の32%ストックPFAを1:8に希釈して4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製し、室温で保存します。固定するエンテロイドの各ウェルに0.5 mLを作ります。 PBSに5%ヤギ血清と0.5%トリトンX-100を加えてブロッキングバッファーを調製します。ウェルあたり最初の抗体用に1 mL、ウェルあたり追加の抗体用に0.5 mLを準備します。注:二次抗体の宿主と同じ種の血清を使用してください 一次抗体および二次抗体を調製し、各抗体について製造業者が推奨する濃度でブロッキングバッファーで希釈する。 PBS中の1 mg/mLストック溶液から1:200に希釈することにより、5 μg/mLのドミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を調製します。染色したエンテロイドのウェルあたり0.5 mLを作ります。 PBSで70%グリセロールを調製し、エンテロイドを顕微鏡スライドに取り付けるための0.5 mLを作ります。 PBS中の25 mg/mLストック溶液を1:5の比率で希釈することにより、5 mg/mLデキストラン-FITC(フルオレセイン-イソチオシアネート)を調製します。マイクロインジェクション用に20μLを作ります。 PBS中のLPS粉末を5 mg/mLストック溶液に再構成することにより、リポ多糖(LPS)およびデキストランFITCを調製します。PBS中のLPSおよびデキストランのストック溶液を0.1 mg/mLおよび0.5 mg/mL LPSおよび5 mg/mLデキストランFITCに希釈します。マイクロインジェクション用に20μLを作ります。 エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N’,N’-四酢酸(EGTA)は、EGTA粉末を蒸留水に溶解し、塩酸(HCl)を用いてpHを約8に調整して0.2Mの原液を作り、調製する。1:100の希釈を行うことにより、培養培地中に2 mMの試験濃度を調製します。 2. 検体採取 サンプルを受け取ったら、検体収集から24時間以内に上皮細胞の分離とメッキを行います。 3. 全検体の基底膜マトリックスにおける腸管上皮細胞プレーティング 注:この手順は、ミシガン大学のトランスレーショナルティッシュモデリングラボラトリー12,13,14からの修正されたプロトコルに従います。高いWnt因子を有する増殖培地を使用すると、腸管樹立について一貫した結果が得られる。エンテロイドが確立されたら、Wnt係数の高い同じ培地を使用して、マイクロインジェクション用のエンテロイドを球形に駆動します。 腸のセグメントを、アムホテリシンを含む氷冷DPBSを含む60 mm x 15 mmのペトリ皿に移し、氷上に20分間浸します。組織が浸っている間に、小腸の領域(十二指腸、空腸、または回腸)を特定し、鉗子とはさみで結合組織と血管を取り除きます。上皮を破壊することなく、23〜25 Gの小さな針と3 mLのシリンジを使用して、必要に応じて内腔の内容物を洗い流します。 メスを使用して腸のセグメントを3〜5 mmの小片に切断し、氷上に0.5〜1 mLのオルガノイド増殖培地を含む35 mm x 15 mmのペトリ皿に1〜2個(6ウェルプレートの1ウェルにメッキ用)を入れます。 解剖マイクロハサミと鉗子を使用して、腸管を縦方向に切断します。鉗子の先端を使用して、10倍の実体顕微鏡で筋膜から上皮細胞をこすり落とします。筋膜を取り除き、皿を旋回させて細胞の塊を砕きます。 20 μLのピペットカットチップを使用して、細胞と培地を5〜10 μL刻みで基底膜マトリックスミックスに移し、8 mg/mLのマトリックスタンパク質濃度で285 μLの溶液を作成します。200 μLのカットチップを使用して、氷上で基底膜マトリックス内の細胞を混合するために、ゆっくりと上下にピペットします。 細胞基底膜マトリックスミックスの50 μLストリップを、温かいフォームブリック上に保持した予熱した6ウェルプレートの1ウェルに入れます。プレートを細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2 で10分間インキュベートし、基底膜マトリックスを重合および硬化させます。 固化した基底膜マトリックスストリップのウェルに2 mLの腸内増殖培地を加え、細胞培養インキュベーター内に戻します。腸管の成長を促進するために毎日メディアを交換してください。腸管幹細胞の分化を毎日10倍倒立顕微鏡でチェックします。 10〜14日後、腸内密度に応じて、エンテロイドを12ウェルまたは6ウェルプレートの1ウェルに通します。一日おきにメディアの交換を開始し、エンテロイドが繁栄し始めると、5〜7日ごとに1:2の比率で渡します。継代中に基底膜マトリックス層でエンテロイドに分化しない細胞を除去します。必要に応じて、80%増殖培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)で凍結することにより、低継代のエンテロイドの凍結ストックを作成します。 4. エンテロイドの免疫蛍光染色 注意: 固定と染色のプロセスには3日かかります。このプロトコルでは、修飾プロトコル15を使用して、核(DAPI)、上皮マーカー(ビリン、CDX2)、リゾチーム、ムチン、およびタイトジャンクションタンパク質(クローディン2、クローディン3、オクルージン、帯状疱疹-1)を固定および染色しました。蛍光画像は共焦点顕微鏡で撮影した。 固定注:このプロセスは通常、腸管通過または凍結手順と同時に行われます。腸管プレートを氷の上に置きます。成長培地を取り外し、冷たいDPBSで2回穏やかに洗浄します。 固定および染色するエンテロイドを特定します。200 μLのカットチップで慎重にピペッティングするか、1 μLの接種ループを使用して、12ウェルプレートに移します。異なる抗体による染色を行う場合は、エンテロイドを別々のウェルに入れます。 200 μLのチップでできるだけ多くの液体を、エンテロイドを乱すことなく除去します。0.5 mLの4%PFAを加え、室温で30分間インキュベートします。プレートを時々回転させて、基底膜マトリックスからのエンテロイドの剥離を容易にします。 基底膜マトリックスからのエンテロイドの剥離を決定するために、肉眼的に調べます。液体PFAを慎重に吸引し、エンテロイドを乱すことなく廃棄します。PBS 3xで洗浄して、PFAと残留基底膜マトリックスを除去します注:実体顕微鏡で液体を吸引すると、エンテロイドを回避するのに役立ちます。固定エンテロイドは、PBSに4°Cで最大1ヶ月間保存できます。 ブロッキング残留PBSを200 μLピペットで、エンテロイドを乱すことなく慎重に除去します。0.5 mLのブロッキングバッファーを加え、室温で2時間インキュベートします。 ブロッキングバッファーを200 μLピペットで除去して廃棄し、エンテロイドを破壊しないように注意してください。 抗体染色ブロッキングバッファー中の一次抗体500 μLをエンテロイドを含む各ウェルに追加します。一次抗体およびリゾチームの場合、希釈係数は1:100、CDX2の場合、希釈係数は1:100、ビリンの場合、希釈係数は1:50です。4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、抗体溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。洗浄ごとに10〜15分のインキュベーション時間を確保してください。 手順 4.3.1.-4.3.2 を繰り返します。希釈倍率が1:400の二次抗体用。 500 μLのDAPIを5 μg/mLのPBS溶液に加え、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、PBSで3回洗浄し、洗浄ごとに10〜15分のインキュベーション時間を確保します マウンティングできるだけ多くのPBSを削除します。染色したエンテロイドを70%グリセロール1回洗浄する。 1 μLの接種ループまたはカットした200 μLのチップを使用してエンテロイドをプレートから持ち上げ、70%グリセロールを顕微鏡スライドガラスにマウントします。 エンテロイドの3D構造を維持するには、下部スライドガラスとカバーガラスの間に0.5〜1mmのスペースを確保してください。薄いシリコンゴムシートまたはガラスカバースリップの切り欠きを使用して、スライドガラスとカバーガラスの間にスペースを作成します。エンテロイドを共焦点顕微鏡でイメージングできるようになりました。 5.エンテロイドのマイクロインジェクションの準備 注:マイクロインジェクションプロトコルは、リソースと設定に合わせてHillら16 から修正されたプロトコルです。一部の準備手順は、数日前に完了する必要があります。 マイクロインジェクションのセットアップマイクロインジェクター装置を、実験の目的に応じて、バイオセーフティキャビネット内またはクリーンカウンターのいずれかに、次のようにセットアップします:観察用の実体顕微鏡、顕微鏡の隣の重いスタンドに取り付けられたX、Y、およびZ軸制御ノブを備えたマイクロマニピュレーター、マイクロマニピュレーターアームに取り付けられたマイクロピペットホルダー、マイクロピペットホルダーと三方活栓を備えたシリンジを接続するマイクロインジェクターチューブ、 次に、空気圧ポンプに接続し、ポンプに接続された壁の空気源に接続します(図1)。 実験使用前および使用後に、マイクロインジェクション装置を70%エタノールで消毒してください。マイクロピペットが目的の標本に到達できることを確認するために軸ノブを動かすなど、顕微鏡とマイクロマニピュレーターの位置を目的の物理的仕様に合わせてテストします。 マイクロピペットの調製メモ: これらの手順は事前に実行してください。マイクロピペットプーラーを使用して、ガラスキャピラリーチューブをマイクロピペットに引き込みます。 実体顕微鏡下で、マイクロピペットを水平マイクロピペットホルダー(図2)に置き、先端に焦点を合わせ、顕微鏡の接眼レンズを通して見ながらマイクロハサミを使用して先端を切り取ります。各実験について、同様のチップサイズで約10〜15個のマイクロピペットを準備します。 0.5〜1μLの液体を引き上げてチップサイズをテストし、ボリュームを空にするために必要なポンプの数を数えます。いくつかのチップサイズをテストして、実験に適したサイズを見つけます。適切なチップサイズは、ポンプあたり約10〜30nLの容量を排出します。 カットガラスのマイクロピペットは、チップを傷つけずに清潔な箱またはチューブに保管してください。注:カット済みのマイクロピペットは市販されています。 腸管製剤主に大きくて球形のエンテロイドのプレートを氷の上に置きます。古い増殖培地を新しい培地と交換します。 基底膜マトリックスドットをセルリフターでプレートから静かに解離します。氷上でゲルドットを左右に旋回させて、エンテロイドを乱すことなく基底膜マトリックスを破壊します。 実体顕微鏡下でカットした20 μLピペットチップで約10〜15個の球状エンテロイドを選択し、基底膜マトリックスに加えて285 μLの8 mg/mLタンパク質濃度混合物を作ります。 カットされた200μLのチップでピペットを軽く上下させ、エンテロイドを壊さずに混ぜます。35 mm x 10 mmの丸い細胞培養ペトリ皿または同様の寸法のペトリ皿の中央に50 μLのゲルドットを5つプレートします。 腸管ゲルドットを37°Cで10分間インキュベートして固化させます。次に、1 mLの新鮮な増殖培地を皿に加えます。安定化のために、そしてエンテロイドが0.5〜1μLの適切なサイズに達するまで、少なくとも2〜3日間インキュベートします。注:エンテロイドへのアクセスを容易にするために壁が低く、成長培地の量を減らすために直径が小さい皿を用意することが重要です。 デキストランFITCおよび試験材料のマイクロインジェクション空気圧ポンプへの三方活栓をオフにします。マイクロピペットに注入された材料(この場合はLPSの有無にかかわらずデキストランFITCを充填します)。 透明なフィルムのストリップで覆われたペトリ皿を準備します。注入された材料の2〜4つの1μLドットをフィルム上に置きます。 マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットの先端を液体のすぐ内側に駆動しますが、実体顕微鏡の視覚化下でフィルムの上にします。シリンジをそっと引っ張って、注入された材料をマイクロピペットに引き出します。 マイクロピペットに2〜4μLの注入材料を満たし、シリンジを押してマイクロピペットの先端の空気を取り除きます。マイクロピペットの注入された材料カラムを検査して、エアポケットがないことを確認します。マイクロピペット内で引き出された注入された材料の量を記録します。注:液体はデキストランFITCにより緑がかった色で見えます。 空気圧ポンプに接続されている空気源をオンにすると、空気圧は約60psiになります。ポンプの電源を入れ、ポンプの持続時間を10〜15ミリ秒に設定します。シリンジの活栓を回して、ポンプからマイクロピペットまでのラインを開きます。注意: ポンプの持続時間が長いほど、ポンプごとにより多くの材料を放出できます。注入量の推定には、実験全体で同じポンプ持続時間と同様のチップサイズのマイクロピペットを使用することをお勧めします。 細胞培養インキュベーターからエンテロイドを取り出し、カバー付き容器内の温かいフォームレンガの上に皿を置き、マイクロインジェクション後の光への露出を制限します。 エンテロイドの入ったペトリ皿を実体顕微鏡下に置き、マイクロマニピュレーターのノブを動かして、マイクロピペットの先端を水平面に対して約35°〜45°の角度で配置します(図3)。これには、事前にある程度の練習が必要です。 顕微鏡下で各ペトリ皿のエンテロイドを視覚化してマッピングし、皿ごとに約3〜5個の球状エンテロイドを注入する計画を立てます。 マイクロピペットの先端が液面に近づいたら、顕微鏡の接眼レンズを覗き込み、先端を標的のエンテロイドに向かって進めます。 正確なゆっくりとした動きを使用してz軸ノブを進めて、マイクロピペットチップで腸管を穿刺します。先端が腸管表面を通過すると、腸壁は押し下げられて飛び出し、その時点で前進が止まるはずです。 片足でポンプペダルをタップし、腸管に緑がかったデキストラン-FITC溶液をわずかに膨張するまで満たします。ポンプ数を記録し、ポンプ容量とデキストラン濃度を算出する。 マイクロインジェクション終了後、マイクロピペットの先端を引き出し、次のエンテロイドに移動します。練習すれば、プロセスはスムーズに進むことができます。チップが壊れた場合は、同様のチップサイズの別のマイクロピペットと交換してください。同じ露光グループ内のすべてのエンテロイドに十分な量の注入材料を引き出し、注入された材料間でマイクロピペットを交換して、相互汚染を回避します。 光にさらされないように、注射した腸管皿を覆いの下に置きます。 デキストランFITCの収集と測定マイクロインジェクション手順の後、直ちに培地を取り出します。新鮮な成長培地で2回洗浄して、残留デキストランFITCを取り除きます。新鮮な培地を追加し、マイクロインジェクション後の時間を時間0として記録します。注意: マイクロインジェクションプロセスを中断することなくこの手順を実行するには、2人目の人が必要になる場合があります。 不透明な0.5 mLマイクロフュージチューブに200 μLの培養液を採取し、マイクロインジェクション後1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、および12時間で、除去した培養培地を同量の新鮮な増殖培地と交換します。注:時間間隔は実験によって異なる場合があります。基底外側ばく露では、交換用媒体は同じ濃度の暴露を含むべきである。 採取した培地を4°Cで保存し、24時間以内にデキストラン濃度を測定する。残りの培地は、他の分析のために-80°Cで保管してください。培地収集の最後に、必要に応じてRNA抽出またはイメージングのためにエンテロイドを回収します。 蛍光マイクロプレートリーダーでデキストランFITC濃度を測定します。 図4に示すように、段階希釈を使用し、線形回帰直線をフィッティングすることにより、各プレートの標準曲線を作成します。 デキストランを含まない新鮮な増殖培地に交換したデキストランを含む培養培地の除去体積の吸光度を次のように補正します:2 mLの培養培地から200 μLを除去すると、10容量%になります。2時間での補正吸光度=(1時間での吸光度x 10%)+2時間で測定された吸光度最初に補正された培地の吸光度は補正を必要としない。そして、検量線式を用いて補正した吸光度値からデキストラン濃度を算出する。 正規化のために、デキストラン濃度を各ペトリ皿のポンプの総数で割り、次に皿あたりのポンプの最大数を掛けます。注:すべての露光はトリプリケートで行われます(露光ごとに3つのペトリ皿、皿ごとに3〜5個のマイクロインジェクションされたエンテロイド)。三重の平均値は、スチューデントのt検定を使用して曝露間で比較されます。