تثبيت أنسجة الفأر الجنيني لتحليل السيتونيم
Summary
هنا ، يتم توفير بروتوكول محسن خطوة بخطوة للتثبيت ، والتلطيخ المناعي ، وتقسيم الأجنة للكشف عن الفيلوبوديا ذات الإشارات المتخصصة التي تسمى cytonemes في تطوير أنسجة الفئران.
Abstract
يعتمد نمط الأنسجة التنموية وتوازن الأنسجة بعد النمو على التسليم المتحكم فيه للإشارات الخلوية التي تسمى المورفوجينات. تعمل المورفوجينات بطريقة تعتمد على التركيز والوقت لتحديد برامج النسخ المتميزة التي توجه وتعزز مصير الخلية. إحدى الآليات التي يتم من خلالها ضمان عتبات الإشارات المورفوجينية المناسبة هي من خلال توصيل بروتينات الإشارات بواسطة فيلوبوديا متخصصة تسمى السيتونيم. السيتونيمات رقيقة جدا (قطرها ≤200 نانومتر) ويمكن أن تنمو إلى أطوال عدة مئات من الميكرون ، مما يجعل الحفاظ عليها لتحليل الصور الثابتة أمرا صعبا. تصف هذه الورقة طريقة محسنة للتعامل الدقيق مع أجنة الفئران من أجل التثبيت والتلطيخ المناعي والتقسيم السميك للسماح بتصور السيتونيمات باستخدام المجهر البؤري القياسي. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لتصور السيتونيمات التي تربط مقصورات الإشارات الخلوية المتميزة أثناء تطوير الأنبوب العصبي للماوس. يمكن أيضا تكييف هذه التقنية للكشف عن السيتونيمات عبر أنواع الأنسجة لتسهيل استجواب الإشارات التنموية بدقة غير مسبوقة.
Introduction
يتم تنسيق التطور الجنيني من خلال التنشيط المنسق لمسارات الإشارات المورفوجينية. المورفوجينات هي بروتينات صغيرة مفرزة يتم تصنيفها إلى القنفذ الصوتي (SHH) ، وتحويل عامل النمو β (TGF-β) / البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) ، وموقع التكامل المرتبط بدون أجنحة (WNT) ، والخلايا الليفية وعامل نمو البشرة (FGF / EGF). يتم إنتاج المورفوجينات وإطلاقها من مراكز التنظيم الخلوي أثناء تطوير الأنسجة وإنشاء تدرجات إشارات عبر المجالات المنظمة للخلايا لإبلاغ تكوين الأنسجة1،2،3،4،5. تم العثور على تمثيل واحد للتدرجات المورفوجينية في الجهاز العصبي النامي ، حيث يتم نقش الجهاز العصبي المركزي المفترض من خلال تنشيط مسار المورفوجين. يتكون هذا النسيج ، الذي يشار إليه باسم الأنبوب العصبي ، من تدرجات متعارضة من SHH تفرزها الصفيحة البطنية والأرضية ، و WNTs / BMPs المفرزة من صفيحة السقف الظهرية ، لنمط مناطق السلف العصبية المتميزة6. يستخدم الأنبوب العصبي عادة للاستجواب في سلامة التدرج المورفوجيني في البحوث التنموية.
يعتمد تكوين التدرج المورفوجيني على التنظيم الصارم لتشتت الإشارة7. إحدى الآليات الخلوية التي يحدث بها ذلك هي من خلال تكوين فيلوبوديا طويلة الإشارات تسمى cytonemes التي تسهل التوصيل المباشر للمورفوجينات من الخلايا المنتجة للإشارة إلى مجموعات الخلايا المستهدفة المحددة. وقد لوحظ أن السيتونيمات تمتد مئات الميكرومترات لإيداع المورفوجينات على أغشية الخلايا المستقبلة للإشارة 8,9. يؤدي تعطيل نقل الموروجين بوساطة السيتونيم إلى شذوذ في النمو في كل من الذباب والفقاريات ، مما يسلط الضوء على أهميتها أثناء نمط الأنسجة10،11،12،13،14.
حتى الآن ، تم توثيق السيتونيمات في نماذج ذبابة الفاكهة والفرخ والزرد ، ولكن تصوير الهياكل في تطوير أجنة الثدييات لا يزال يمثل تحديا8،9،15. تتمثل إحدى العقبات التي تحول دون تصوير السيتونيمات بفعالية في أنسجة الثدييات المعقدة في الموقع في طبيعتها الرقيقة والهشة ، مما يجعلها عرضة للتلف بطرق التثبيت التقليدية8. لقد قمنا سابقا بتطوير وتحسين بروتوكولات لتثبيت المجهر الإلكتروني المعدل (MEM-fix) للحفاظ على السيتونيمات في الخلايا المستزرعة وتمكين دراستها باستخدام المجهر البؤري16,17.
سمح استخدام تقنية MEM-fix بتحديد بعض الجزيئات المشاركة في تكوين السيتونيم الناجم عن SHH ووظيفته11،16،17. ومع ذلك ، فإن تأكيد هذه النتائج في السياق ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية لنمط الأنبوب العصبي استلزم تطوير تقنيات جديدة لإصلاح وتصوير الأنسجة الجنينية للفئران. يتم توضيح بروتوكول لإصلاح أجنة الفئران بطريقة تحافظ على سلامة السيتونيم وتسمح بالتلطيخ المناعي والتقسيم اللاحق للأنسجة الجنينية للتحليل البؤري هنا. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام بروتين فلورسنت أخضر مربوط بالغشاء (GFP) لتسمية امتدادات الغشاء من الخلايا المنتجة ل SHH في الأنبوب العصبي النامي. وسيعالج تنفيذ هذا البروتوكول الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها والمتعلقة بانتشار السيتونيمات وأهميتها في تطوير نظم الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير هذا البروتوكول للحفاظ على السيتونيمات الحساسة في أقسام الأنسجة الجنينية للفحص المجهري الفلوري عالي الدقة. حتى الآن ، اعتمد تصور السيتونيمات في الأنسجة عبر الكائنات الحية النموذجية المختلفة إلى حد كبير على التعبير خارج الرحم عن البروتينات ذات العلامات الفلورية باستخدام تصوير الأنسجة الحية. لسوء الحظ ، نادرا ما يؤدي استخدام التصوير الحي الموسوم بالفلورسنت إلى تحليل البروتينات المعبر عنها داخليا ، ويمكن أن يؤدي إلى قيود زمنية ، ويتطلب مراحل تصوير ومجاهر متخصصة. تحافظ طريقة التلطيخ والتقسيم الموصوفة هنا على السيتونيمات وغيرها من الامتدادات الخلوية للسماح بالكيمياء النسيجية المناعية للكشف النهائي عن البروتينات المعبر عنها داخليا. ستسهل هذه التقنية رؤى جديدة حول كيفية نقل المورفوجينات عبر الأنسجة المختلفة في الجسم الحي وتوسع نطاق أنظمة النماذج حيث يمكن دراسة السيتونيم.
يستخدم هذا البروتوكول تلطيخا كاملا وتقسيما سميكا للاهتزاز ، مما يتجنب استخدام محلول التوازن مثل الجلسرين أو المحاليل المبردة مثل السكروز. ويهدف إلى تقليل التعامل مع الأنسجة المجزأة للسماح بالحفاظ على أقصى قدر من الامتدادات الخلوية. أدى تقليل التعامل مع الأنسجة بعد التقسيم إلى توفير نتائج أفضل باستمرار في الحفاظ على السيتونيم بشكل عام. وبالتالي ، فإن تقسيم الجنين هو أحد الخطوات النهائية قبل التصوير.
MEM-fix، وهي تقنية تثبيت تم تطويرها للحفاظ على السيتونيمات من الخلايا المستزرعة، يتكون من مزيج من الجلوتارالدهيد وPFA الذي يسمح بتحسين الحفاظ على بنية الخلايا الفطرية ثلاثية الأبعاد مقارنة بأبعادها الحية16,17. لسوء الحظ ، لم يكن MEM-fix مفيدا لتثبيت الجنين لأن glutaraldehyde يمكن أن يتوهج تلقائيا ويحد بشدة من اختراق الأجسام المضادة وربط epitope في الخلايا بسبب نشاط الربط المتبادل عالي البروتين22,23. وهكذا ، تم تحسين بروتوكولات التقسيم بعد ظروف تثبيت PFA للسماح بالحفاظ على الامتدادات الخلوية في الأنسجة الجنينية. على الرغم من أن PFA يمكن أن يحافظ على امتدادات تشبه السيتونيم في الأنسجة الجنينية ، إلا أنه يجب إجراء تحليل الصور بحذر. يمكن أن يسبب PFA جفافا جزئيا للخلايا والأنسجة الفردية ، مما يؤدي إلى تقليل طفيف في الحجم وتشكيل مساحات صغيرة خارج الخلية داخل الأنسجة الثابتة.
يتجنب هذا البروتوكول الخطوات الإضافية لإعادة تشبع السكروز للحماية من التبريد وإزالة الأنسجة لأن محاليل السكروز أو الجلسرين يمكن أن تسبب تشبعا طفيفا للأنسجة24. يمكن أن يؤدي التورم الطفيف الناتج إلى تدمير الامتدادات الخلوية الثابتة والسيتونيمات المهاجرة بين الخلايا وعبر الأنسجة. كان هذا واضحا عند مقارنة الاهتزاز السميك المقسم بأقسام cryostat. على الرغم من أن زيادة سمك الأنسجة حسنت من الحفاظ على السيتونيمات السليمة ، إلا أن أقسام cryostat المشبعة بالسكروز كانت باستمرار أقل في حدوث السيتونيمات التي يمكن اكتشافها.
كشف تحسين هذا البروتوكول أن المقاطع التي يبلغ سمكها 100 ميكرومتر كانت الأفضل لضمان الحفاظ على السيتونيمات السليمة. عادة ما تستخدم المقاطع الأرق للتصوير لأن معظم المجاهر البؤرية قادرة فقط على التصوير بدقة كافية لتصور الامتدادات الخلوية على عمق ~ 20-40 ميكرومتر دون مسح25. ومع ذلك ، فإن القوى الميكانيكية والتشويه المطبق على الخلايا الجنينية من الشفرة أثناء قطع الأقسام الرقيقة يدمر السيتونيم. تسمح الأقسام الأكثر سمكا بمساحة أكبر من العمق داخل القسم مع الحفاظ على الامتدادات السليمة داخل الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أقسام أكثر سمكا يسمح بسهولة التعامل معها لمنع الطي المفرط أو التواء أقسام الأنسجة.
تم تحسين هذا البروتوكول لتحقيق أقصى قدر من الحفاظ على السيتونيمات في أنسجة أجنة الفئران E8-10.5. الحد الأدنى من التلاعب بالأنسجة بعد التقسيم وفر باستمرار تحسين الحفظ العام للسيتونيم. من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لتكييف التقنية مع مراحل النمو اللاحقة وأقسام الأنسجة البالغة بسبب زيادة الحجم وتعقيد الأنسجة. سيتطلب ذلك تقسيما متبوعا بتلطيخ التألق المناعي. قد تتطلب هذه الأنسجة خطوات إزالة إضافية وتكييف التعامل مع الأنسجة أثناء التقسيم للحفاظ على الامتدادات الشبيهة بالسيتونيم. وسيلزم النظر في هذه الخطوات الإضافية ومعالجتها من أجل التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم الحصول على الصور باستخدام المجاهر التي يحتفظ بها مركز التصوير الخلوي والجزيئي في مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال. تم الحصول على سلالات الماوس من JAX. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM122546 (SKO) ومن قبل ALSAC من مستشفى سانت جود لأبحاث الأطفال.
Materials
| 12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
| 24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| 60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
| Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
| Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
| Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
| chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
| CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
| Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
| Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
| Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
| Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
| Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
| Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
| Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
| Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
| Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
| PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
| Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
| Super Glue | Gorilla | ||
| SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
| TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
| Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
| Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |
References
- Crick, F. Diffusion in embryogenesis. Nature. 225 (5231), 420-422 (1970).
- Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
- Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
- Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
- Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014 (2009).
- Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
- Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
- Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
- Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
- Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
- Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432 (2021).
- Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979 (2016).
- Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058 (2021).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953 (2018).
- Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
- Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
- American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
- Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 368-380 (2006).
- Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).
