Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione dei depositi adiposi di topo e l’isolamento e la digestione delle rispettive arterie per liberare e quindi identificare la popolazione di cellule endoteliali. Le cellule appena isolate utilizzate nelle applicazioni a valle faranno progredire la comprensione della biologia delle cellule vascolari e dei meccanismi della disfunzione vascolare.
Le cellule endoteliali vascolari che rivestono la parete del sistema vascolare svolgono ruoli importanti in una varietà di processi fisiologici, tra cui la regolazione del tono vascolare, le funzioni di barriera e l’angiogenesi. La disfunzione delle cellule endoteliali è un fattore predittivo caratteristico e un importante fattore per la progressione di gravi malattie cardiovascolari, ma i meccanismi sottostanti rimangono poco compresi. La capacità di isolare ed eseguire analisi su cellule endoteliali da vari letti vascolari nella loro forma nativa fornirà informazioni sui processi delle malattie cardiovascolari. Questo protocollo presenta la procedura per la dissezione dei tessuti adiposi sottocutanei e mesenterici del topo, seguita dall’isolamento della rispettiva vascolarizzazione arteriosa. Le arterie isolate vengono quindi digerite utilizzando uno specifico cocktail di enzimi digestivi focalizzati sulla liberazione di cellule endoteliali funzionalmente vitali. Il tessuto digerito viene valutato mediante analisi citometrica a flusso utilizzando cellule CD31+/CD45− come marcatori per l’identificazione positiva delle cellule endoteliali. Le cellule possono essere selezionate per saggi funzionali immediati a valle o utilizzate per generare linee cellulari primarie. La tecnica di isolamento e digestione delle arterie da diversi letti vascolari fornirà opzioni per i ricercatori per valutare le cellule vascolari appena isolate dalle arterie di interesse e consentire loro di eseguire una vasta gamma di test funzionali su specifici tipi di cellule.
Le cellule endoteliali sono ben note per i loro ruoli importanti in una varietà di processi fisiologici, tra cui le funzioni di barriera, l’angiogenesi e la regolazione del tono vascolare 1,2. Sebbene la disfunzione delle cellule endoteliali sia ben documentata nel promuovere l’aterosclerosi, l’ipertensione, il diabete, ecc., I meccanismi sottostanti alla guida della disfunzione endoteliale rimangono poco conosciuti e probabilmente differiscono tra letti vascolari distinti 2,3,4. Lo sforzo di svelare questi meccanismi patologici della disfunzione delle cellule endoteliali è messo in discussione dal limitato accesso a una popolazione pura di cellule endoteliali dai tessuti e/o dai cambiamenti fenotipici delle cellule endoteliali in coltura 5,6. Pertanto, essere in grado di isolare ed eseguire analisi su cellule endoteliali da vari letti vascolari nella loro forma nativa darà informazioni sui processi delle malattie cardiovascolari.
Questo protocollo presenta la procedura per sezionare i tessuti adiposi sottocutanei e mesenterici dai topi, seguita dall’isolamento della rispettiva vascolarizzazione arteriosa. Le cellule endoteliali funzionalmente vitali che rivestono le pareti arteriose vengono liberate utilizzando uno specifico cocktail di enzimi. Particolare attenzione è stata posta nell’ottimizzare le condizioni del protocollo di digestione per ottenere una resa sufficiente di cellule endoteliali da <1 mg di tessuto di partenza, mantenendo intatti i marcatori biomolecolari per l'analisi. Le cellule endoteliali isolate vengono successivamente identificate utilizzando la citometria a flusso. La presenza di CD31 (PECAM) viene utilizzata principalmente per identificare le cellule endoteliali. A causa dell'espressione di CD31 in altri tipi cellulari, tra cui diversi di origine ematopoietica che esprimono anche CD45, la purezza delle cellule endoteliali isolate è stata ulteriormente aumentata dall'esclusione di cellule che esprimono sia CD31 che CD45 5,6,7,8. Inoltre, a seconda della domanda di ricerca e delle applicazioni a valle da impiegare, i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione la selezione di un ampio pannello di marcatori di selezione positivi e negativi per ottimizzare la purezza della popolazione cellulare di interesse.
Sebbene la tecnica di sezionare e isolare le arterie adipose dei depositi sia stata utilizzata nelle precedenti pubblicazioni 9,10,11,12,13, un protocollo dettagliato che descrive l’isolamento delle arterie incorporate deve ancora essere presentato. Dimostrare la tecnica per l’isolamento e la digestione delle arterie da diversi letti vascolari di una determinata specie di interesse fornirà opzioni per i ricercatori per valutare le cellule vascolari appena isolate dalle arterie di interesse e consentire loro di eseguire una vasta gamma di test funzionali su specifici tipi di cellule. I test possono includere, ma non sono limitati a, citometria a flusso per il selezione cellulare e l’espressione proteica di membrana5,8, elettrofisiologia per l’attività dei canali ionici9, profilazione molecolare (proteomica / analisi genomica, ecc.) 14,15, e la generazione di linee cellulari primarie per lo screening farmacologico in vitro16,17.
La disfunzione endoteliale è un precursore di gravi stati patologici, probabilmente guidando lo sviluppo di aterosclerosi, ipertensione e ictus 3,23. Mentre i meccanismi identificati alla base della disfunzione endoteliale in una data condizione patologica sono molti, è probabile che letti vascolari distinti siano influenzati in modo differenziale da condizioni patologiche 4,24. Inoltre, diversi fattori di rischio cardiovascolare (ad esempio, obesità, ipertensione, dislipidemia, fumo, diabete) inducono disfunzioni attraverso una varietà di meccanismi distinti23,25. Pertanto, è fondamentale isolare le popolazioni di cellule endoteliali da modelli animali consolidati di malattia o tessuto umano accessibile ed eseguire saggi su cellule immediatamente rimosse dall’ambiente in vivo. Isolare le cellule in questo modo ha un vantaggio unico rispetto allo studio delle cellule in coltura in quanto sono prive di cambiamenti fenotipici indotti dalla coltura 5,6. Inoltre, includere una popolazione eterogenea di cellule endoteliali, come osservato in vivo 26,27 (e che può essere ulteriormente separata utilizzando la selezione cellulare assistita dal flusso), da un organismo vivo informa meglio l’ambiente in vivo. Infine, questo metodo è applicabile allo studio di numerosi modelli animali e tessuti potenzialmente umani e può essere utilizzato per generare linee di coltura cellulare primaria, se tale necessità è giustificata.
Il passo critico in questo protocollo, e il passo che richiederà la maggior parte degli aggiustamenti per diversi letti vascolari o tipi di cellule non presentati qui, è la digestione del tessuto vascolare. Questo passaggio deve essere ottimizzato per la salute delle cellule senza diminuire la resa cellulare. Gli enzimi specifici utilizzati e la durata della digestione sono fondamentali per ottimizzare la salute e la resa cellulare per essere in grado di eseguire adeguatamente i saggi a valle. Per l’identificazione dell’espressione di membrana di CD36, come rilevato dalla citometria a flusso nelle cellule endoteliali sottocutanee e mesenteriche (Figura 4), è stata sviluppata una versione modificata del protocollo di digestione originariamente progettato per l’elettrofisiologia patch-clamp28 . Ciò includeva un’estensione del tempo di digestione della collagenasi I a 30 minuti per aumentare la resa cellulare per soddisfare meglio le esigenze della citometria a flusso rispetto a quanto richiesto per gli studi patch-clamp. Poiché questa modifica può avere un impatto sulla salute delle cellule in una certa misura, nelle analisi di citometria a flusso è stata utilizzata una colorazione di vitalità cellulare per garantire che solo le cellule endoteliali vitali fossero valutate seguendo questo protocollo (Figura 3). Si raccomanda che gli studi volti a isolare le cellule dal tessuto vascolare includano un marcatore per la vitalità cellulare prima di valutare l’approccio desiderato.
Il protocollo descritto è sufficiente per liberare cellule endoteliali vitali per l’analisi e le applicazioni a valle da campioni arteriosi di ≤1 mg derivati da topi; Tuttavia, se le arterie di interesse dovessero essere isolate da diversi tessuti o organismi (ad esempio, gli esseri umani) che si tradurrebbero in masse arteriose significativamente diverse, si dovrebbe ottimizzare il contenuto di enzimi di digestione e la durata dell’incubazione per isolare in modo efficiente la popolazione cellulare di interesse. Per alcuni letti vascolari che iniziano con quantità ancora più piccole di tessuto iniziale rispetto ai letti sottocutanei e mesenterici presentati qui (ad esempio, arterie coronarie), può essere necessario raggruppare le arterie di diversi topi per campione. In effetti, questo può essere un passo necessario per qualsiasi dato letto vascolare dato che l’approccio di esito richiede una resa cellulare relativamente elevata. Una delle principali limitazioni è che, a causa della natura delle variazioni per digestione del campione, le rese cellulari possono talvolta essere significativamente diverse tra i lotti anche quando provengono dallo stesso letto vascolare. Ciò può causare problemi durante l’analisi dei dati e deve essere tenuto in considerazione tramite la normalizzazione quando appropriato. Ad esempio, l’espressione di CD36 era estremamente variabile nei dati grezzi a causa di alterazioni nelle rese cellulari tra i singoli campioni di arterie adipose sottocutanee e mesenteriche. Pertanto, i dati grezzi sono stati normalizzati all’intensità media di fluorescenza CD31+CD45− con l’ipotesi che questo metodo correggesse le differenze di lotto (Figura 4). Naturalmente, a seconda dell’approccio, possono essere necessarie analisi statistiche più sofisticate e metodi di normalizzazione.
In sintesi, questo articolo presenta un metodo per sezionare, isolare e digerire le arterie sottocutanee e mesenteriche dai topi per studiare l’espressione e / o la funzione dei bersagli endoteliali di interesse. Con le modifiche al protocollo presentato, è possibile studiare diversi letti vascolari e tipi di cellule (ad esempio, cellule muscolari lisce). Questo protocollo, come base per una pletora di approcci sperimentali disponibili, ha il potenziale per far progredire la comprensione della biologia delle cellule vascolari e dei meccanismi della disfunzione vascolare.
The authors have nothing to disclose.
In affettuosa memoria di Rich West, un brillante scienziato, collega e caro amico. Vorremmo ringraziare l’Università del Delaware Flow Cytometry e BioImaging Core come parte del Delaware Biotechnology Institute per i loro continui contributi ai nostri studi. Vorremmo anche ringraziare Emma Hudgins per l’attenta revisione e revisione del manoscritto. Il nostro lavoro è supportato dal National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Questo progetto è stato sostenuto anche dal programma Delaware INBRE, con una sovvenzione del NIGMS (P20GM103446) del National Institutes of Health e dello Stato del Delaware (I.S. Fancher), e una borsa di ricerca dell’Università del Delaware General University (I.S. Fancher). Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale di NIH.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |