Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.
La malaria es un importante problema de salud pública, que presenta más de 200 millones de casos por año en todo el mundo. A pesar de años de esfuerzos científicos, la inmunidad protectora contra la malaria todavía es poco conocida, principalmente debido a las limitaciones metodológicas del cultivo de Plasmodium a largo plazo, especialmente para Plasmodium vivax. La mayoría de los estudios se han centrado en la protección de inmunidad adaptativa contra la malaria por anticuerpos, que desempeñan un papel clave en el control de la malaria. Sin embargo, la protección estéril inducida por las vacunas atenuadas contra Plasmodium sporozoites está relacionada con la respuesta celular, principalmente a los linfocitos T citotóxicos, como los linfocitos T CD8+ y gamma delta (γδ T). Por lo tanto, se deben desarrollar nuevas metodologías para comprender mejor las funciones de la respuesta inmune celular y, por lo tanto, apoyar la terapia futura y el desarrollo de vacunas. Para encontrar una nueva estrategia para analizar esta inmunidad mediada por células a la infección en estadio sanguíneo por Plasmodium, nuestro grupo estableció un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados (iRBC) por linfocitos citotóxicos. Este ensayo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de respuesta inmune celular contra diferentes Plasmodium spp. en la etapa sanguínea. Las células inmunes citotóxicas innatas y adaptativas pueden eliminar directamente los glóbulos rojos iXi y el parásito intracelular en un mecanismo efector:objetivo. Los iRBC objetivo se etiquetan para evaluar la viabilidad celular y se cocultivan con células efectoras (CD8+ T, γδ T, células NK, etc.). El porcentaje de lisis se calcula en función de las condiciones probadas, en comparación con un control de lisis espontánea en un ensayo basado en citometría de flujo. En última instancia, esta metodología de ensayo de eliminación es un gran avance en la comprensión de la inmunidad mediada por células a la malaria en etapa sanguínea, ayudando a descubrir nuevos objetivos terapéuticos potenciales y acelerar el desarrollo de vacunas contra la malaria.
La malaria sigue siendo una crisis sanitaria mundial, con más de 240 millones de casos y 627.000 muertes relacionadas con la malaria notificadas en 20201. Actualmente hay cinco especies parasitarias que pueden causar malaria en humanos, de las cuales Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax son las dos especies más prevalentes. Durante la infección por Plasmodium , la etapa hepática o preeritrocítica es asintomática, y los síntomas solo ocurren durante el ciclo asexual del parásito en la etapa eritrocítica. En esta etapa de infección, miles de merozoítos derivados de la etapa hepática se liberan en el torrente sanguíneo e infectan los glóbulos rojos (RBC). En el RBC, los parásitos se diferencian en trofozoítos y esquizontes por esquizogonía, hasta que los esquizontes rompen el eritrocito, liberando merozoítos recién formados, repitiendo este ciclo sanguíneo. Los ciclos repetidos de invasión, replicación y liberación de merozoíto dan como resultado un crecimiento exponencial de la población de parásitos y, en última instancia, desencadenan los síntomas de la enfermedad2.
Un desafío importante en el estudio de la respuesta inmune a la malaria es que el Plasmodium spp. que infecta a los seres humanos no infecta a los modelos de animales de laboratorio. Por lo tanto, las muestras de pacientes infectados con Plasmodium deben recogerse frescas y procesarse y analizarse inmediatamente. Sin embargo, en las zonas donde el paludismo es endémico, los recursos para acceder a los mecanismos inmunológicos y moleculares son limitados. Debido a estas limitaciones, los roedores son ampliamente utilizados como modelos experimentales para investigar la respuesta inmune contra la infección por Plasmodium. Mientras que P. berghei y P. chabaudi se utilizan a menudo como sustitutos de la infección por P. falciparum, la cepa no letal de P. yoelii 17XNL también tiene muchas características en común con P. vivax, como la infección restringida por reticulocitos 3,4. El desarrollo de ensayos in vitro de Plasmodio, que pueden utilizarse para muestras derivadas de modelos humanos o animales, es valioso para comprender mejor la patogénesis de la malaria y comparar la respuesta inmunológica provocada por diferentes especies del parásito.
La inmunidad antipalúdica protectora no se comprende completamente ni en la etapa preeritrocítica ni en la etapa sanguínea. Se sabe que la exposición a infecciones repetidas resulta en inmunidad adquirida parcial, pero la inmunidad estéril rara vez se desarrolla5. Durante décadas, la inmunidad protectora anti-Plasmodium se asoció principalmente con la inducción de anticuerpos neutralizantes u opsonizantes que previenen la invasión parasitaria de las células huésped o conducen a la fagocitosis por las células presentadoras de antígeno, respectivamente6. Como resultado, la mayoría de los esfuerzos para producir vacunas antipalúdicas hasta ahora se han basado en la inducción de anticuerpos protectores y duraderos 7,8. Sin embargo, la protección estéril inducida por la vacunación con un esporozoíto atenuado se correlaciona directamente con la activación y expansión de los linfocitos T citotóxicos 8,9.
Recientemente, algunos estudios de muestras de pacientes recién aisladas y cultivos in vitro han demostrado que las células inmunes citotóxicas innatas o adaptativas como CD8 + T 10, γδ T11 y las células NK12 pueden eliminar directamente los glóbulos rojos infectados por Plasmodium y su parásito intracelular de una manera de relación efector: objetivo. Estos hallazgos seminales definieron un mecanismo efector inmune completamente nuevo en el contexto de la malaria. Para diseccionar esta nueva inmunidad antipalúdica, es esencial explorar los mecanismos efectores citotóxicos de las células asesinas contra los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la infección natural o la vacunación.
Aquí presentamos un ensayo in vitro que mide la actividad citotóxica de los linfocitos contra la malaria en la etapa sanguínea. Este ensayo puede ayudar a dilucidar los mecanismos de la respuesta inmune celular contra la etapa de eritrocitos de Plasmodium . Las células diana, los glóbulos rojos i, se marcan con éster de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) para evaluar la viabilidad celular, y luego se cocultivan con células efectoras como los linfocitos citotóxicos (CTL). Este cocultivo se evalúa luego mediante citometría de flujo, utilizando marcadores fluorescentes para tipos específicos de células. Finalmente, el porcentaje de lisis de eritrocitos por CTL se calcula dividiendo la condición experimental por la ruptura espontánea de los glóbulos rojos y el control de la lisis espontánea, que ocurre durante la incubación sin la célula efectora. En general, esta metodología de ensayo de matanza puede contribuir a una mejor comprensión de la inmunidad de la malaria mediada por células.
Aquí describimos un ensayo in vitro para medir la destrucción de glóbulos rojos infectados con Plasmodium por linfocitos citotóxicos. Este ensayo puede ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad protectora celular a la etapa eritrocítica del parásito de la malaria. La principal ventaja de esta metodología es que proporciona un ensayo cuantitativo de la destrucción mediada por células de los glóbulos rojos iR que se puede utilizar para abordar muchas preguntas sobre cómo las células inmun…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Dhelio Pereira y a los miembros del Centro de Investigación en Medicina Tropical de Rondônia (CEPEM) por la inscripción de pacientes con malaria y la recolección de sangre y a Felicia Ho por ayudar con la revisión del manuscrito. El siguiente reactivo se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA- 817, contribución de Ana Rodriguez. Esta investigación fue apoyada por el Fondo de Investigación Lemann Brasil, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, becas (CJ, GC, CG) y Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – beca (LL).
100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |