In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

La malaria sigue siendo una crisis sanitaria mundial, con más de 240 millones de casos y 627.000 muertes relacionadas con la malaria notificadas en 2020¹. Actualmente hay cinco especies parasitarias que pueden causar malaria en humanos, de las cuales Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax son las dos especies más prevalentes. Durante la infección por Plasmodium , la etapa hepática o preeritrocítica es asintomática, y los síntomas solo ocurren durante el ciclo asexual del parásito en la etapa eritrocítica. En esta etapa de infección, miles de merozoítos derivados de la etapa hepática se liberan en el torrente sanguíneo e infectan los glóbulos rojos (RBC). En el RBC, los parásitos se diferencian en trofozoítos y esquizontes por esquizogonía, hasta que los esquizontes rompen el eritrocito, liberando merozoítos recién formados, repitiendo este ciclo sanguíneo. Los ciclos repetidos de invasión, replicación y liberación de merozoíto dan como resultado un crecimiento exponencial de la población de parásitos y, en última instancia, desencadenan los síntomas de la enfermedad².

Un desafío importante en el estudio de la respuesta inmune a la malaria es que el Plasmodium spp. que infecta a los seres humanos no infecta a los modelos de animales de laboratorio. Por lo tanto, las muestras de pacientes infectados con Plasmodium deben recogerse frescas y procesarse y analizarse inmediatamente. Sin embargo, en las zonas donde el paludismo es endémico, los recursos para acceder a los mecanismos inmunológicos y moleculares son limitados. Debido a estas limitaciones, los roedores son ampliamente utilizados como modelos experimentales para investigar la respuesta inmune contra la infección por Plasmodium. Mientras que P. berghei y P. chabaudi se utilizan a menudo como sustitutos de la infección por P. falciparum, la cepa no letal de P. yoelii 17XNL también tiene muchas características en común con P. vivax, como la infección restringida por reticulocitos ^3,4. El desarrollo de ensayos in vitro de Plasmodio, que pueden utilizarse para muestras derivadas de modelos humanos o animales, es valioso para comprender mejor la patogénesis de la malaria y comparar la respuesta inmunológica provocada por diferentes especies del parásito.

La inmunidad antipalúdica protectora no se comprende completamente ni en la etapa preeritrocítica ni en la etapa sanguínea. Se sabe que la exposición a infecciones repetidas resulta en inmunidad adquirida parcial, pero la inmunidad estéril rara vez se desarrolla⁵. Durante décadas, la inmunidad protectora anti-Plasmodium se asoció principalmente con la inducción de anticuerpos neutralizantes u opsonizantes que previenen la invasión parasitaria de las células huésped o conducen a la fagocitosis por las células presentadoras de antígeno, respectivamente⁶. Como resultado, la mayoría de los esfuerzos para producir vacunas antipalúdicas hasta ahora se han basado en la inducción de anticuerpos protectores y duraderos ^7,8. Sin embargo, la protección estéril inducida por la vacunación con un esporozoíto atenuado se correlaciona directamente con la activación y expansión de los linfocitos T citotóxicos ^8,9.

Recientemente, algunos estudios de muestras de pacientes recién aisladas y cultivos in vitro han demostrado que las células inmunes citotóxicas innatas o adaptativas como CD8 ⁺ T 10, γδ T¹¹ y las células NK¹² pueden eliminar directamente los glóbulos rojos infectados por Plasmodium y su parásito intracelular de una manera de relación efector: objetivo. Estos hallazgos seminales definieron un mecanismo efector inmune completamente nuevo en el contexto de la malaria. Para diseccionar esta nueva inmunidad antipalúdica, es esencial explorar los mecanismos efectores citotóxicos de las células asesinas contra los glóbulos rojos infectados (iRBC) en la infección natural o la vacunación.

Aquí presentamos un ensayo in vitro que mide la actividad citotóxica de los linfocitos contra la malaria en la etapa sanguínea. Este ensayo puede ayudar a dilucidar los mecanismos de la respuesta inmune celular contra la etapa de eritrocitos de Plasmodium . Las células diana, los glóbulos rojos i, se marcan con éster de carboxifluoresceína succinimidil (CFSE) para evaluar la viabilidad celular, y luego se cocultivan con células efectoras como los linfocitos citotóxicos (CTL). Este cocultivo se evalúa luego mediante citometría de flujo, utilizando marcadores fluorescentes para tipos específicos de células. Finalmente, el porcentaje de lisis de eritrocitos por CTL se calcula dividiendo la condición experimental por la ruptura espontánea de los glóbulos rojos y el control de la lisis espontánea, que ocurre durante la incubación sin la célula efectora. En general, esta metodología de ensayo de matanza puede contribuir a una mejor comprensión de la inmunidad de la malaria mediada por células.