Denne protokollen beskriver fremstillingen av rotte hele isjias nervevev for ex vivo elektrofysiologisk stimulering og registrering i et miljøregulert, to-roms, perfundert saltvannsbad.
Ex vivo preparater muliggjør studiet av mange nevrofysiologiske prosesser isolert fra resten av kroppen mens du bevarer lokal vevsstruktur. Dette arbeidet beskriver utarbeidelsen av rotteisjiasnervene for ex vivo nevrofysiologi, inkludert bufferforberedelse, dyreprosedyrer, utstyrsoppsett og nevrofysiologisk opptak. Dette arbeidet gir en oversikt over de ulike typer eksperimenter som er mulig med denne metoden. Den skisserte metoden tar sikte på å gi 6 timers stimulering og registrering på ekstrahert perifert nervevev i tett kontrollerte forhold for optimal konsistens i resultatene. Resultater oppnådd ved hjelp av denne metoden er A-fiber sammensatte virkningspotensialer (CAP) med topp-til-topp amplituder i millivoltområdet over hele eksperimentets varighet. CAP-amplituder og former er konsistente og pålitelige, noe som gjør dem nyttige for å teste og sammenligne nye elektroder med eksisterende modeller, eller effekten av intervensjoner på vevet, for eksempel bruk av kjemikalier, kirurgiske endringer eller nevromodulatoriske stimuleringsteknikker. Både konvensjonelle kommersielt tilgjengelige mansjettelektroder med platina-iridiumkontakter og skreddersydde ledende elastomerelektroder ble testet og ga lignende resultater når det gjelder nerve stimulus styrke-varighetsrespons.
Den nåværende forståelsen av grunnleggende nervefunksjon som modellert i silico mangler i flere aspekter, spesielt med hensyn til effekten av nervevevsdeling utenfor soma, axon og dendritter. Axon-myelin interaksjoner er fortsatt dårlig forstått som det fremgår av det faktum at selv detaljerte beregningsmessige nervemodeller som MRG1 (for pattedyrnerver) som tilstrekkelig fanger konvensjonell elektrisk stimuleringsrespons, ikke fanger opp andre eksperimentelt observerte atferd som høyfrekvent blokkoverførsel2 eller sekundær utbruddsrespons3.
Denne protokollen gir en metode for effektivt å undersøke nevrofysiologiske prosesser på nervenivå i en akutt liten laboratoriedyrmodell, ved hjelp av en standardisert forberedelsesprotokoll for å isolere nerven, kontrollere miljøet og fjerne den fra en in vivo-kontekst til en ex vivo-kontekst. Dette vil forhindre andre kroppsprosesser eller bedøvelse som brukes av in vivo nervestimulering protokoller for å endre nerveadferd og forvirre målte resultater eller deres tolkning 4,5. Dette muliggjør utvikling av mer realistiske modeller som utelukkende fokuserer på effekter som er spesifikke for nervevev som er dårlig forstått. Denne protokollen er også nyttig som test for ny nervestimulering og registrering av elektrodematerialer og geometrier, samt nye stimuleringsparadigmer som høyfrekvent blokk 2,3. Variasjoner av denne teknikken har tidligere blitt brukt til å studere nervefysiologi under tett kontrollerte forhold6, for eksempel for å måle ionkanaldynamikk og egenskaper eller effekten av lokalbedøvelse7.
Denne teknikken gir flere fordeler sammenlignet med alternativer som akutt in vivo liten dyreforsøk8. Teknikken hindrer behovet for å opprettholde anestesidybden ettersom vevet har blitt ekstrahert fra kroppen, og reduserer mengden nødvendig utstyr som en bedøvelsesdiffusor, oksygenkonsentrator og varmepute. Dette forenkler den eksperimentelle protokollen, noe som reduserer risikoen for feil. Siden bedøvelse kan potensielt endre nervefunksjonen4, sikrer denne teknikken at tiltak ikke blir forvirret av bivirkninger fra disse bedøvelsesforbindelsene. Til slutt er denne teknikken mer hensiktsmessig enn akutte in vivo-eksperimenter når du studerer effekten av nevrotoksiske forbindelser som tetrodotoxin, som ville drepe et bedøvet dyr ved lammelse.
Perifere nerveseksjoner er et unikt ex vivo-system siden det er stor sjanse for at fibrene som er ansvarlige for registrerte nevrale signaler ikke inneholder noen soma. Som disse normalt ville være plassert, for motoriske nevroner, i ryggraden, og for sensoriske nevroner i dorsalrot ganglia ved siden av ryggraden, kan forberedelsen av en del av pattedyrnerven grovt modelleres som en samling av rørformede membraner med ionkanaler, åpen i begge ender9. Metabolisme opprettholdes av mitokondriene som ligger i axonen på tidspunktet for vevs disseksjon10. Suturering av de åpne endene av axolemma oppfordres etter ekstraksjon for å lukke dem og dermed bidra til å opprettholde eksisterende ioniske gradienter over membranen, noe som er avgjørende for normal nervefunksjon.
For å opprettholde vev homeostase utenfor kroppen, må flere miljøvariabler kontrolleres tett. Disse er temperatur11, oksygenering12, osmolaritet, pH13,14, og tilgang til glukose for å opprettholde metabolisme. For denne protokollen er tilnærmingen å bruke en modifisert Krebs-Henseleit buffer15,16 (mKHB) kontinuerlig forverret med en blanding av oksygen og karbondioksid. mKHB er i familien av kardiolegiske buffere 6,17 brukes til å bevare dissekert vev utenfor kroppen, for eksempel i ex vivo eksperimenter. Disse bufferne inneholder ikke hemoglobin, antibiotika eller antifungals og er derfor bare egnet for preparater som involverer små mengder vev i en begrenset periode. pH-kontroll ble oppnådd med karbonat- og karbondioksidredoksparet, som krever konstant lufting av bufferen med karbondioksid for å opprettholde pH-likevekt. Dette er for å unngå å bruke andre vanlige buffermidler som HEPES, som kan endre nervecellefunksjonen18. For å oksygenere bufferen og gi pH-kontroll ble det brukt en blanding av 5 % karbondioksid i oksygen kalt karbogen (95 % O2, 5 % CO2). En varmerører ble brukt til temperaturkontroll av en bufferbeholder, og bufferen ble perfundert gjennom et nervebad, og deretter resirkulert til startbeholderen. Et typisk eksperiment ville vare 6-8 timer før nerven mister sin levedyktighet og ikke lenger reagerer tilstrekkelig på stimulering for tiltak for å være representativ for sunt vev.
For å optimalisere signal-til-støy-forholdet ble sølvkloridelektroder brukt til opptak, som ble utarbeidet i henhold til tidligere beskrevne metoder19. For stimulering kan en kombinasjon av kommersielle off-the-shelf platina mansjettelektroder og skreddersydde ledende polymermansjettelektroder brukes. Ledende polymermansjettelektroder har spesielt høyere ladekapasitet, noe som er nyttig når du stimulerer nerven ved hjelp av høy amplitudebølgeformer20.
Stimulatoren som brukes i denne protokollen, er tidligere beskrevet20. Dokumentasjon, utformingsfiler og programvareskript som skal brukes, er offentlig tilgjengelig21. Andre stimulatorer kan brukes til å utføre denne protokollen. Imidlertid er den tilpassede stimulatoren også i stand til høyfrekvent alternativ strøm (HFAC) blokk 2,20, noe som muliggjør et bredere spekter av nevrofysiologiske eksperimenter. For å bruke HFAC-blokk anbefales ledende elastomermansjetter for å unngå skade på nerven. Ledende elastomernervemansjetter er myke og fullt polymere elektrodekjeder produsert av ledende elastomerer som ledende komponent og polydimetylsiloksan som isolasjon22. Enheter ble produsert i en bipolar konfigurasjon ved hjelp av konvensjonelle lasermikrofabrikasjonsteknikker.
I dette arbeidet beskrev vi en protokoll for å forberede rotte isjiasnervene for ex vivo nevrofysiologi. Vevsekstraksjon tar omtrent 30 minutter, inkludert dyrehåndtering, anestesi, avhorning og disseksjon, mens nerverengjøring, plassering i badekaret og elektrodeimplantasjon bør kreve ytterligere 30 minutter før opptak kan startes. Bufferforberedelse kan utføres på 30 min, selv om dette kan gjøres før resten av eksperimentet. Denne typen forberedelse og eksperiment har blitt brukt og beskrevet i de sis…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Dr. Gerald Hunsberger fra GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, konge av Preussen, PA, USA og Galvani Bioelectronics (Stevenage, Storbritannia) for å dele sin opprinnelige nerveforberedelsesteknikk med oss. Forfatterne anerkjenner Robert Toth for dual-chamber nerve bad design. Forfatterne erkjenner finansiering fra Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) stipend fra Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). Forfatterne anerkjenner High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) fra Imperial College London for finansiering av Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux er for tiden finansiert av UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Forfatterne anerkjenner takknemlig Zack Bailey fra Imperial College, ved Institutt for bioingeniør, for hjelp med eksperimenter og tilgang til dyrevev under produksjonen av JoVE-videoartikkelen.
1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |