גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים

חרקי לפידופטרן מייצגים יותר מ-10% מכלל המינים החיים המתוארים¹, ומיני טקסה מסוימים גורמים נזק חמור לצמחים ולאובדן חקלאי חמור ^2,3. למרות שמחקרים מולקולריים וגנטיים פותחו באמצעות חרקי מודל כגון תולעת המשי בומביקס מורי ^4,5, חרקים מזיקים נותרים ללא התערבות, בין היתר בגלל קשיי הגידול והטיפול^ב-6,7. לכן, מחקרים בסיסיים וטכניקות נחוצים כדי להבין את הביולוגיה של חרקים מזיקים כאלה שאינם מודל.

ה-Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים⁸. מבין טקסי החרקים, טורטריקס התה האוריינטלי Homona magnanima Diakonoff ופירות הקיץ Tortrix Adoxophyes honmai Yasuda הם מזיקים פוליפגוטיים רציניים הידועים כמזיקים לעצי תה במזרח אסיה⁷. שני המינים מטילים אשכולות ביצים שטוחים וסגלגלים דמויי קשקשים (או מסות ביצים) המורכבים מביצים דקות, רכות ושבריריות המכוסות בהפרשות אימהיות. אף על פי ששלבי העוברים הם חיוניים להתפתחות החרקים ולקביעת המין⁹, מבנים של הביציות מונעים ניתוח נוסף מהבנת הביולוגיה של החרקים. חשוב להתגבר על הקשיים למחקר נוסף על מזיקים המזיקים המסתבכים עם מסת ביצה מורכבת כזו.

כאן, כדי להבין את הביולוגיה של טורטרידים, פותחו שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים באמצעות A. honmai ו - H. magnanima. ראשית, שיטות גידול המוני שומרות על שני הטורטרידים במשך 100 דורות על ידי גזע. הפרדת הביציות ממסת הביצית דמוית הקשקשים המשורשרים אפשרה תצפית עוברית על הטורטרידים באמצעות ממיסים אלקליין ואורגניים שפותחו בעבר מטכניקות ששימשו בזבובים¹⁰. בנוסף, המחקר הנוכחי ביסס אפליה מינית של עוברים קטנים על ידי פיתוח שיטות צביעה של כרומטין המין של נקבות lepidopteran באמצעות orcein לקטי-אצטי¹¹. על ידי שילוב שיטות אלה, חומצות גרעין באיכות גבוהה ובכמות הופקו מעוברים שנקבעו על ידי מין, שאחרת היה קשה לקבוע⁶. הרנ"א שחולץ שימש לריצוף הדור הבא. באופן קולקטיבי, השיטות המוצגות כאן חלות על חרקים לפידופטרנים אחרים ועל טקסות חרקים אחרות.

1. איסוף חרקים וגידול המוני

1. לאסוף חרקים טורטריים משדות בעקבות הפניות שפורסמו בעבר ^8,12.
   הערה: זחלי H. magnanima ו-A. honmai נאספים מעלי תה פגומים (איור 1A); מבוגרים נמשכים באמצעות אור UV נייד של 4 W (אורך גל של 365 ננומטר, ראו טבלת חומרים, איור 1B).
2. גבו את הזחלים שנאספו (איור 1C,D) בנפרד על פיסת תזונה מלאכותית בכוס של 1/2 אונקיה במשך 2-3 שבועות עד להסתרה בוגרת (איור 1E,F). אשרו את מין הגלמים והבוגרים על ידי תכונות מורפולוגיות (איור 1G,I).
3. הצמידו את הזכרים והנקבות בקופסת פלסטיק (30 ס"מ על 20 ס"מ על 5 ס"מ) למסות ביצים אוביפוזיט על נייר פרפין (איור 1J-L). הניחו נקבה ושני זכרים בכוס פלסטיק של 120 מ"ל עם פיסת נייר פרפין כדי ליצור מטרלין.
   הערה: חשוב להכין קמטים על נייר הפרפין. עבור H. magnanima, נייר פרפין צריך להיות בתחתית המארז. בינתיים, עבור A. honmai, שים נייר על תקרת המארז כדי לאסוף ביצים (איור 1L) מכיוון שמסת הביצה של H. magnanima oviposit בצד העליון של עלי התה, אך A. honmai מטיל ביצים על החלק התחתון של העלים⁸. הנהלים אומתו גם במינים טורטריים אחרים, ועדיף להניח ניירות משני הצדדים אם האקולוגיה וההתנהגות של מיני המטרה אינם מסווגים.
4. חותכים את מסות הביצים (בערך 100-200 ביצים למסת ביצה¹², איור 1M) על נייר הפרפין עם מספריים. מניחים את הביצים בכוס של 1/2 אונקיה עם נייר זרוק למשך 5-7 ימים.
   הערה: העובר הבוגר מציג קפסולת ראש שחור (איור 1N). התקופות של embryogenesis מיוחסות באופן מגוון למינים טורטריים, אך בדרך כלל 5 ימים לאחר ההטלה (dpo) עבור H. magnanima ו-4 dpo עבור A. honmai ב-25 °C עם 60% לחות יחסית, 16 שעות אור/8 שעות מחזורי חושך⁷.
5. אחסנו את המוני הביצים המציגות כמוסות ראש שחורות בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים.
6. פורסים כ-60 גרם דיאטות מלאכותיות באמצעות פומפיה לגידול המוני. מניחים את מסת הביצית המלאה בעוברים בוגרים על התזונה המלאכותית הפרוסה במיכל פלסטיק (23 ס"מ על 16 ס"מ על 8 ס"מ). הניחו ניירות פרפין על מסת הביצה בעזרת הדיאטות הפרושות (איור 10).
   הערה: מתחת ל-30% לחות יחסית נחשבת יבשה מדי, בעוד שלמעלה מ-70% לחה מדי. עדיף ליצור חורים במכסה של מיכל הפלסטיק כדי לאפשר אוורור טוב יותר. מלאו את החורים בכותנה כדי למנוע בריחות של זחלים קטנים.
7. כדי לסלק מזהמים פני השטח מהביצים, להשרות את מסת הביצה לתוך 3% פורמלין ו 0.2% תמיסת בנזלקוניום כלוריד במשך 5 דקות, בהתאמה¹². כדי למגר חיידקי מעיים או חיידקים תוך-תאיים, השתמשו בתזונה מלאכותית בתוספת 0.05% (w/w) טטרציקלין הידרוכלוריד או 0.06% (w/w) ריפאמפיצין במקום תזונה מלאכותית רגילה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי. חשוב ללוש את Silk Mate 2S ו-0.05% (w/w) טטרציקלין הידרוכלוריד או 0.06% (w/w) ריפאמפיצין באופן שווה לצורך עקביות.
8. אספו את הגלמים ממיכל הפלסטיק והבדילו את המין על סמך¹² מאפיינים מורפולוגיים (איור 1G-I).
   הערה: באופן כללי, טורטרידים מציגים 5-6 אינסטארים עד לגור¹². הזחלים H. magnanima ו - A. honmai לוקחים 3 שבועות ושבועיים, בהתאמה, לאחר הבקיעה עד הגור.
9. הניחו 15 זכרים ו-10 נקבות בקופסת פלסטיק (30 ס"מ על 20 ס"מ x 5 ס"מ, איור 1K) להזדווגות עם 25 מעלות צלזיוס, 16 ליטר/8 ד', אספו ביצים ל-5-7 ימים וחזור על שלבים 1.4-1.9. לכל דור.
   הערה: אם יש צורך באיסוף המוני ביצים חדשים לניתוח מאוחר יותר, הגדר את ההתחלה והסיום של התקופה החשוכה, למשל, מ-9 בבוקר עד 17:00. במצב זה, H. magnanima ו - A. honami בדרך כלל ביצי oviposit לאחר 5 שעות (14:00).

2. הפרדת ביצים וזחלי pharate ממסות ביצים לקיבוע, חלחול וכתמים

1. השרו את מסת הביצה לתוך 1,000 μL של 1.2% נתרן היפוכלוריט תמיסה מימית למשך 10 דקות או לתוך 1,000 μL של 5 M אשלגן הידרוקסיד תמיסה מימית במשך 30 דקות כדי להפריד את הביצים.
2. שטפו את הביצים המופרדות ב-1,000 μL של PBSt (137 mM NaCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 0.05% של פוליאוקסיאתילן (20) סורביטן מונולאוראט [Tween-20] pH 7.4, ראו טבלת חומרים) בעקבות הדו"ח שפורסם בעבר⁷.
3. השרו ביצים בתערובת של 500 μL של 100% הפטאן ו-500 μL של תמיסת 4% paraformaldehyde-PBSt (w/v). מערבבים במשך 10 דקות ב-1,500 סל"ד באמצעות מערבל מערבל מערבולות.
4. השרו את הביצים לתערובת של 500 מיקרול'ל של 100% הפטאן ו-500 מיקרול' של 100% מתנול. מערבבים במשך 10 דקות ב-1,500 סל"ד.
5. שטפו את הביצים פעמיים עם 1,000 μL של 100% מתנול ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-100% מתנול עד לניסויים נוספים (איור 2A).
   הערה: ניתן לאחסן את הביצים לפחות לשנה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. משרים את הביצים ברצף ב-99%, 70%, 50% אתנול ו-PBSt למשך 5 דקות כל אחת לצורך הידרופיליזציה בעקבות דו"ח⁷ שפורסם בעבר.
7. שטפו את הביצים עם PBSt, טבלו את הביצים ב-1 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת DAPI למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו את הביצים עם 1x PBS פעמיים. השרו את הביצים ב-20 מיקרול' של תמיסת אורצין לקטית-אצטית של 1.25% (w/w) (ראו טבלת חומרים)¹¹ כדי לדמיין את ההטרוכרומטין עד שהגרעינים יציגו צבע אדום בוהק (זה נע בין 5-60 דקות) (איור 2B,C).
   הערה: תקופות הכתמת האורצין הלקטי-אצטי תלויות בטמפרטורה ובלחות. עדיף לבדוק אם יש צביעה נכונה באמצעות מיקרוסקופ עם הגדלה של 4x-10x.
8. מעבירים את הביצים הוויטראז'יות באמצעות פיפטה למגלשת זכוכית. הצמידו את הביצים המוכתמות לריאגנט אנטיפאד (ראו טבלת חומרים) וזכוכית כיסוי⁷.
9. חלצו את הזחלים pharate H. magnanima ו-A. honmai (4-5 ימים לאחר ההטבעה (dpo)) ממסות הביצים באמצעות מלקחיים (איור 2D). זחלים דו-כיווניים על מגלשת זכוכית (איור 2E).
10. לתקן את כל הרקמות (למשל, גנגליון תת-וושט, גרעיני בית החזה, צינורית מלפיגית וכו ') עם תערובת של 1:3 (v/v) 99.7% חומצה אצטית/100% מתנול למשך 5 דקות. הכתימו את אלה בתמיסת אורצין לקטית-אצטית^{11 ב-1.25} % עד שהגרעינים מוכתמים (פעולה זו יכולה להימשך 5-60 דקות, בהתאם לטמפרטורה וללחות).
11. קבעו את המין של כל דגימה על ידי התבוננות בנוכחות (נקבה) או בהיעדר (זכר) של הטרוכרומטין (כרומוזום W, איור 2F,G) תחת מיקרוסקופ.
    הערה: המין נקבע על ידי הדמיה של כרומטין המין. כל תא מייצג את כרומטין המין כנקודה אצל נקבות^11,12, בעוד שהחלק הנותר של רקמות הזחל של pharate (לא קבוע) צריך להיות שקוע באופן מיידי במאגר ליזה של תאים¹² (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, ו-1% SDS, pH 8.0) או ריאגנטים המכילים RNA המכילים פנול עבור מיצוי DNA או RNA. לפני הניתוחים, מחלקים מראש 20 μL של הריאגנטים לתוך צינורות PCR של 0.2 מ"ל (איור 3A). לטבול ולאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) עד למיצוי נוסף. ניתן לאחסן את הדגימות במשך 3 חודשים לפחות, אך עדיף להמשיך בניסויים במורד הזרם כדי למנוע פירוק של חומצות גרעין.

3. מיצויי דנ"א ורנ"א ממין קבעו זחלי פאראט

1. רכזו 12 זחלי פאראט זכרים או נקבות שנקבעו על ידי המין (5 עוברי dpo) והוסיפו את מאגר הליזיס של התא או ריאגנטים להפקת RNA (ראו שלב 2.11 וטבלת החומרים) לצינור אחד של 1.5 מ"ל.
   הערה: בצע את שלבים 3.2-3.7 למיצוי DNA ואת שלבים 3.8-3.11 למיצוי RNA.
2. הומוגניזציה של רקמות ב-600 μL של מאגר הליזיס של התא (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ו-1% SDS, pH 8.0), וצנטריפוגות הדגימות ב-10,000 x g למשך 5 דקות ב-4 °C (74 °F).
3. אספו את הסופרנאטנט (500 μL) באמצעות פיפטה ודגרו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם 1.5 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) למשך 5 שעות על בלוק חום.
4. טפלו בדגימות עם 1.0 μL של 10 מ"ג/מ"ל של תמיסת RNase (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
5. הוסף 200 μL של תמיסת משקעים חלבונית (ראה טבלת חומרים) לצינורות⁷, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 17,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (76 °F).
6. מערבבים את הסופרנאטל (500 μL) עם 500 μL של 100% איזופרופנול, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-20,400 x g למשך 10 דקות ב-4 °C (75 °F).
7. לשטוף את הדנ"א הכדורי פעמיים עם 1,000 μL של 70% אתנול. לאחר מכן, יבש באוויר (5-10 דקות בטמפרטורת החדר), ממיס את הדנ"א ב-30 מיקרול'ל של חיץ Tris-Cl של 10 mM (pH 8.5).
8. הומוגניזציה של הרקמות ב-600 μL של ריאגנטים להפקת RNA והוספת 240 μL של מים מזוקקים טהורים במיוחד לצינור. צנטריפוגה את הצינורות ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (64 °F).
9. מערבבים את הסופרנאטנט (600 μL) עם 600 μL של 100% איזופרופנול ומעבירים את התערובת לעמודת ספין סיליקה (ראו טבלת חומרים). צנטריפוגה את הצינורות ב 17,900 x g במשך דקה אחת ב 4 °C (64 °F).
10. שטפו את העמודה ב-750 μL של 70% אתנול, וצנטריפוגה של העמודה פעמיים ב-17,900 x גרם למשך דקה אחת כל אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. טען 15 μL של מים מזוקקים טהורים במיוחד לעמוד. צנטריפוגה של הצינורות ב-17,900 x g למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחמוק מה-RNA.
12. חישוב ואמת את האיכות והכמות של דנ"א ורנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס UV. הערך את טוהר חומצות הגרעין באמצעות יחס A260/A280 (חומצות גרעין/חלבון) ו-A260/A230 (חומצות גרעין/מלחים ומזהמים אחרים)¹³.
    הערה: עבור מיצוי RNA, בוצע הליך¹² שפורסם בעבר, אשר הביא לזיהום פנול (טבלה 1). הדנ"א והרנ"א המופקים מעובר יחיד או מזחלי pharate מניבים דגימות בעלות כמות נמוכה ובאיכות נמוכה. בדרך כלל, מיצוי דנ"א מ-12 זחלי pharate מניב 100-600 ננוגרם, בעוד שמיצוי RNA בשיטה הנוכחית מייצר 900-1,500 ננוגרם, כפי שמוצג בטבלה 1.
    הערה: שלבים 3.13-3.15 הם אופציונליים לבדיקות נוספות של ריצופי תפוקה גבוהה.
13. חשב את כמויות הדנ"א והרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מבוסס פלואורסצנציה.
    הערה: היחס בין כמויות הרנ"א (ריכוז מבוסס UV (ng/μL)/ריכוז מבוסס פלואורסצנציה (ng/μL)) חושב כדי להעריך את האיכות ליישום ניסיוני נוסף. לדוגמה, כאשר ריכוזי UV וריכוזים פלואורסצנטיים הם 80 ng/uL ו-60 ng/uL, בהתאמה, היחס יהיה 1.5 (80/60). בדרך כלל, יחסים מתחת ל-1.5 מצביעים על טוהר מספיק עבור יישומים במורד הזרם באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה¹³.
14. נתח את איכות הרנ"א באמצעות שבב אלקטרופורזה¹⁴.
15. השתמש ב-RNA המוסמך כדי להכין את ספריית הרנ"א באמצעות ערכת הכנת ספריית RNA (ראה טבלת חומרים). רוצף את הספריות באמצעות פלטפורמה המתאימה לספריות המוכנות.

הקמת קווים מארחים ותחזוקתם
הכדאיות של זחלים שנאספו בשדה מיוחסת באופן שונה למיקום השדה, לעונות השנה ולתנאי הגידול (למשל, 90% מהכדאיות בטייוואן, טאויואן, כפי שמוצג ב-Arai et ^al.12). כ-30%-50% מהזוגות ייצרו את הדור הבא כרגיל. עבור H. magnanima ו - A. honmai, מטרילינים נשמרו על ידי רבייה במשך למעלה מ-100 דורות.

תצפיות מורפולוגיות וקביעות מין
הטיפול באשלגן הידרוקסיד (3 או 5 M KOH) או בנתרן היפוכלוריט (1.2% Cl₂ או NaClO) מפריד בין ביצים לבין מסות הביצים המשורשרות שלהן (איור 2A). הריכוז הנמוך יותר של הריאגנטים לא הצליח להשיג הפרדה. כל שלבי הקיבוע, החדירה והכתם אפשרו הדמיה של גרעינים באמצעות תמיסת DAPI. הביצים שטופלו רק ב-KOH או ב-NaClO (מופרדות) ללא שלבי הקיבוע והחדירה לא הוכתמו בצבעים אלה⁷. המוני הביצים של H. magnanima שלא טופלו לא היו מוכתמים. האורצין הלקטי-אצטי מכתים את ההטרוכרומטין (כרומוזום W) בצבע אדום כהה וגרעינים עם צבע אדום בוהק כרגיל (איור 3A). צביעה זו מאפשרת קביעת מין קלה ומהירה מעובר 4 dpo לזחלי כוכב שישי. למרות שגרעינים צולמו בעוברי 0-3 dpo, היה קשה לצפות בכרומוזום W עם הגדלה של פי 400.

דנ"א ורנ"א באיכות גבוהה התקבלו מעוברים שנקבעו על ידי המין ומאגרו
מ-12 זחלי פאראט, דנ"א באיכות גבוהה (A260/A280 = 1.7-2.0; A260/A230 = 1.7-2.4) הוצאו עם 100-600 ננוגרם בכמות הכוללת (טבלה 1). למרות שהרנ"א שחולץ בעקבות השיטה שפורסמה בעבר¹² הניב מוצר של 500-1,000 ננוגרם באיכות נמוכה: A260/A280 = 1.7-2.1; A260/A230 = 0.1-0.5 (טבלה 1), הפרוטוקולים ששונו באמצעות עמודת ספין שיפרו את איכות הרנ"א, והפיקו 900-1,500 ננוגרם עם A260/A280 = 1.9-2.1 ו- A260/A230 = 1.9-2.3 (טבלה 1). יתר על כן, יחס ריכוז הרנ"א (ערכים מבוססי UV/Qbit פלואורסצנציה) עבור הפרוטוקול המתוקן היה מתחת ל-1.2, ועמד בדרישות האיכות לריצוף הדור הבא¹³. לעומת זאת, האיכות והכמות של חומצות גרעין שהופקו מעובר יחיד היו נמוכות מכדי שניתן יהיה לחשבן. שלמותו של הרנ"א שחולץ מזחלי pharate שנקבעו על ידי מין באמצעות הפרוטוקול שהשתנה אושרה גם באמצעות אלקטרופורזה של שבב (איור 3B). הספריות המוכנות אושרו כמניבות תוצאות גבוהות של Q30 (טבלה 2).

איור 1: סקירה כללית של איסוף חרקים וגידול המוני של H. magnanima ו-A. honmai. (A) עלי תה וקינים שניזוקו על ידי זחל. (B) מלכודת אור עם אור UV. (ג,ד) נקבה (C) וזכר (D)^זחל כוכב 6 של H. magnanima. המשולש הכתום מציין את האשכים. (ה,ו) הזחלים שנאספו גודלו בנפרד בכוס של 1/2 אונקיה עם חתיכת תזונה מלאכותית. (ז,ח) גלמים של ה' מגנימה (ז) וא ' הונמאי (ח). הנקבה מוצגת משמאל, ואילו הזכר מוצג מימין. (I) המבוגרים של H. magnanima (לעיל) ו - A. honmai (להלן). גם הזכרים וגם הנקבות מוצגים מימין ומשמאל, בהתאמה. (י,ק) שקית ניילון (J) או מארז פלסטיק (K) לאיסוף מסת ביצים. (L) A. honmai oviposit ביצים על נייר פרפין המונח על המכסה, ו - H. magnanima מטילים ביצים על נייר פרפין המונח על קרקעית המארז. (מ,נ) מסת ביצה של H. magnanima. העוברים הבוגרים מציגים כמוסות ראש שחורות המסומנות בחצים לבנים (N). (O) דיאטות מלאכותיות פרוסות עם פומפיה לגידול המוני. הזחלים הבוקעים מביצים, שהונחו על התזונה הפרוסה, ייצרו גלמים 3-4 שבועות לאחר הבקיעה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (מתחת ל-16 שעות אור/8 שעות מחזור כהה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תצפיות על עוברים. (A) הביציות המופרדות, הקבועות והמחלחלות של H. magnanima באמצעות 5 N KOH, 4% PFA / הפטאן, מתנול/הפטאן ומתנול. ביצה מופרדת מודגשת בקווים שבורים. (B) עובר 3 dpo היה מוכתם באורצין לקטי-אצטי. ראש החץ השחור מציין את העובר. (C) עובר 4 dpo היה מוכתם ב- DAPI. ראש החץ הלבן מציין את העובר. (ד,ה) כריתה של זחלי pharate (5 dpo) באמצעות מלקחיים. זחלי הפאראטה מופקים ממסת ביצה (D), חתוכים על מגלשת זכוכית (E). (ו,ז) צביעת אורצ'ין לקטית-אצטית באמצעות זחלי הפאזה המנותקים. נקבות מציגות את ההטרוכרומטין כנקודה (מסומנת בראש חץ שחור, (F), אך לזכרים אין את ההטרוכרומטין (G). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: סיכום גרפי של מיצוי חומצות גרעין תוך שימוש בזחלי pharate ו-RNA שנקבעו על ידי מין של H. magnanima ו-A. honmai. (A) רקמות של זחלי פאראט שנותחו על מגלשות זכוכית הוכתמו באורצין לקטי-אצטי כדי לקבוע את מינם. שאר הרקמות היו ספוגות בריאגנטים, אוחדו לתוך צינור אחד ממוין לפי מין הפרטים, ולאחר מכן עברו מיצוי DNA/RNA. (B) איכות הרנ"א שחולץ מ-12 זכרים מסוג H. magnanima או A. honmai הוערכה באמצעות מערכת אלקטרופורזה של שבבים. קיצורים: [nt], גודל נוקלאוטידים; [FU], יחידה פלואורסצנטית; M, סמן מולקולרי; הממ, ה. מגנימה; Ad, A. honmai. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: ריכוז ואיכות של חומצות גרעין המופקות ממין קבעו זחלי פאראט של H. magnanima. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: איכויות של נתונים גולמיים של ריצוף RNA. ¹ Q20 (%) מציין את ההסתברות לקריאות עם דיוק קריאה של 99%. ² Q30 (%) מציין את ההסתברות לקריאות עם דיוק קריאה של 99.9%. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טורטרייד כולל מספר מזיקים חקלאיים וייעוריים; המחקר הנוכחי הציג שיטות לגידול טורטריקס במשך דורות, התבוננות באמבריוגנזה ובמין של החרקים, וביצוע אנליזה מולקולרית באמצעות עוברים בוגרים.

אחד המכשולים בחקר חרקי ההדברה הוא קביעת שיטות גידול. במיוחד, הרבייה לפעמים להשפיע על הכושר של המין באופן שלילי. ירידת הכושר על ידי הגזע, הנקרא דיכאון רבייה, נצפתה באופן נרחב בצמחים ובבעלי חיים שונים, כולל חרקים 15,16,17,18. כאמור, גם H. magnanima וגם A. honmai נשמרו במשך למעלה מ -100 דורות (יותר מ -10 שנים) ללא עלויות כושר נראות לעין. אף על פי שאין זה מספיק כדי להעריך אם גם לטורטרידים אחרים יש עמידות גבוהה להתרבות באופן כללי, ייתכן ששני המינים פיתחו את המאפיינים על ידי התאמת תנאי סביבה מונוטוניים (כלומר, מטעי תה) ונגד מספר מיקרואורגניזמים אנדוסימביוטיים (למשל, וולבצ'יה^11,12 ). את הביצים של שני המינים ניתן להשיג בקלות, אך התנהגויות ה-oviposition שלהן מיוחסות באופן שונה לאקולוגיה שלהן. ואכן, נראה כי הלחות וכיוון הקמט משפיעים באופן ישיר על מספר הביצים האוביפוזיטיות, מה שעשוי לשקף את ההיסטוריה הטבעית של החרקים בשדות. חשוב להתאים את שיטות הגידול למינים לגבי המאפיינים הביולוגיים שלהם בטבע.

הפרוטוקולים שנקבעו במחקר זה אפשרו תצפית על עוברים ועל מחקרים מולקולריים באמצעות עוברים וזחלים בוגרים שנקבעו על ידי מין. ביצי החרקים מצופים בדרך כלל במספר שכבות קליפה ^10,19. יתר על כן, הביצים של H. magnanima ו- A. honmai מכוסות בהפרשות אימהיות. כדי להכתים את הביצים במבנה מורכב כזה, נראה כי הפרדה, קיבוע וחדירה הם כל הצורך. ב- Ostrinia furnacalis (Crambidae), אשר oviposits מסת ביצה דמוית קנה מידה כגון H. magnanima ו- A. honmai, הוצעו פרוטוקולים לקביעת מין מבוססי PCR באמצעות עוברים בודדים, אך האיכות והכמות הנמוכה של חומצות גרעין היוו בעיה לניתוח מאוחר יותר ^6,20. לעומת זאת, המחקר הנוכחי הציע לחלץ חומצות גרעין מעוברים המאוגדים במין לאחר התבוננות בכרומטין מין ספציפי לנקבה. רנ"א מתפרקים בקלות, והליך החילוץ המוצג כאן לא השפיע על איכות הרנ"א, שאושר גם על ידי ניתוח השעתוק (RNA-seq). הטכניקות המוצגות כאן ישימות למחקרים על עוברי של מיני חרקים שונים. בנוסף, לפרוטוקולים יש פוטנציאל לשמש להערכת ההשפעות של חומרי הדברה כימיים או חיידקים תוך תאיים כמו וולבצ'יה, הגורמת למומים ספציפיים למין במהלך עוברי ^6,11,12.

למחקר הנוכחי יש מספר מגבלות. ראשית, היה קשה לקבוע את מין העוברים הלא בוגרים (0-3 dpo) באמצעות צביעת אורצינים לקטיים-אצטיים ב- H. magnanima ו- A. honmai. הסיבה לכך היא שמספרם וגודלם של הגרעינים הם בדרך כלל קטנים במהלך הלידה המוקדמת, מה שמקשה על התצפית על כרומוזום W. כדי להבהיר את המין של הטורטרידים במהלך העוברים המוקדמים, זיהוי וכימות של סמנים על כרומוזומי מין ^6,20 יכול להיות גישה חלופית. שנית, היה קשה לחלץ חומצות גרעין בטוהר גבוה מאדם יחיד לאחר קביעת המין, אולי בגלל מספר התאים הקטן. עם זאת, הרנ"א או הדנ"א המופקים מעובר יחיד עשויים לחול על ניתוחים מאוחרים יותר כגון בדיקות PCR וריצוף חד-תאי.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מתאר גידול מסה, תצפיות מורפולוגיות וניתוחים גנטיים של ביצים של שני חרקים מזיקים לפידופטרנים שאינם מודל, H. magnanima ו- A. honmai. טכניקות פשוטות אלה צפויות להיות ישימות למחקר נוסף על חרקי טורטריד, לפידופטרנים אחרים וטקסונים אחרים.