使用CLARITY方法结合病毒载体转导和大脑清除,可以同时研究大量神经元和星形胶质细胞。
使用CLARITY方法将病毒载体转导和组织清除相结合,可以同时研究几种类型的脑细胞及其相互作用。病毒载体转导能够在同一组织内以不同的荧光颜色标记不同的细胞类型。细胞可以通过活动或投射进行遗传识别。使用改进的CLARITY方案,星形胶质细胞和神经元的潜在样本量增加了2-3个数量级。CLARITY的使用允许对完整的星形胶质细胞进行成像,这些星形胶质细胞太大而无法将其全部放入切片中,并检查体细胞及其所有过程。此外,它还提供了研究星形胶质细胞与不同神经元细胞类型之间的空间相互作用的机会,即每个星形细胞域中锥体神经元的数量或星形胶质细胞与特定抑制神经元群体之间的接近程度。本文详细介绍了如何应用这些方法。
近年来,星形胶质细胞功能以及它们如何与神经元回路相互作用的知识急剧增加。星形胶质细胞可以影响可塑性1,2,帮助神经元损伤后恢复3,4,甚至诱导 从头 神经元增强,最近的研究表明星形胶质细胞在记忆获取和奖励中的重要性,以前被认为是纯粹的神经元功能5,6,7.星形胶质细胞研究中特别感兴趣的一个特征是细胞的空间排列,其在海马体和其他大脑结构中保持独特的空间组织8,9,10。与在细胞体瘤之间交织的神经元树突不同,海马星形胶质细胞栖息在视觉上可区分的区域,其过程之间略有重叠,形成不同的结构域8,11,12,13。支持星形胶质细胞参与神经元回路的证据并不支持缺乏对这些群体及其结构域中的神经元的详细解剖学描述14。
病毒载体转导程序以及转基因动物(TG)已被推广为研究大脑结构,功能和细胞相互作用的工具集15,16。利用不同的启动子允许根据其遗传特性,激活水平17,18或投射靶标靶向特定细胞。不同的病毒可以在不同的人群中表达不同颜色的荧光基团。病毒可以与TG中荧光团的内源性表达相结合,或者TG动物可以在不需要病毒的情况下使用。这些技术被广泛用于神经元标记,一些实验室已经开始使用它们,并专门用于靶向其他细胞类型(如星形胶质细胞5,9,19)进行修改。
CLARITY技术于2013年20,21年首次描述,通过使整个大脑透明,同时保持微观结构完整,能够研究厚厚的脑切片。通过结合两种方法 – 病毒载体转导和组织清除 – 现在可以选择检查不同细胞类型群体之间的空间相互作用。大多数星形胶质细胞 – 神经元相互作用研究是在薄脑切片上进行的,由于其大结构域导致不完全星形胶质细胞的图像,从而从根本上限制了分析细胞的数量。使用CLARITY技术可以同时对大规模体积的细胞群进行单细胞分辨率表征。对清晰大脑中荧光标记的细胞群进行成像并不能提供突触分辨率,但可以彻底表征星形胶质细胞与各种神经元细胞类型之间的空间相互作用。
出于这个原因,我们利用这些最先进的技术来研究整个背侧CA1星形胶质细胞的特性,对所有层层(层状镭骨,锥体层和地层Oriens)进行成像。我们测量了数以万计的星形胶质细胞(病毒外显率为>96%5),从而分析了CA1周围整个星形细胞群体的信息。通过神经元标志物的有效外显率,我们可以记录整个CA1星形胶质细胞群与四种类型的神经元细胞之间的相互作用 – 小白蛋白(PV),生长抑素(SST),VIP抑制神经元和兴奋性锥体细胞9。
使用来自TG动物的荧光和不同颜色的病毒载体(所有抑制性细胞)的组合进行了几次实验,而其他(兴奋性)利用两种病毒载体在不同启动子下表达不同的荧光团9。本文提出了一个详细的方案,包括标记大脑中所需细胞,使用修改后的CLARITY程序使大脑透明,以及使用各种程序和软件成像和分析完整的大脑结构。
组织清除方法是大脑研究中的革命性工具,引发了以前无法提出的问题。通过靶向一小群细胞,单个细胞甚至单个突触的特性,CLARITY现在可以通过使用相关的荧光团来靶向总细胞群或远距离连接特征。
荧光基团表达和CLARITY程序组合的结果不是二元的;许多因素可能会干扰导致次优结果的程序。首先,荧光基团的表达必须事先验证。由于CLARITY程序会导致一些信息丢失,因此在C…
The authors have nothing to disclose.
该项目已获得欧洲研究理事会(ERC)根据欧盟地平线2020研究和创新计划(赠款协议No 803589),以色列科学基金会(ISF赠款No.1815/18)和加拿大 – 以色列赠款(CIHR-ISF,第2591/18号赠款)的资助。我们感谢Nechama Novick对整个手稿的评论。
AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
NaOH | Sigma | #S5881 | |
PBS | |||
PFA 4% | EMS | #15710 | |
RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
SDS | Sigma | #L3771 | |
SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |