JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Published: March 09, 2022
doi:
10.3791/63501
, , ,
1Department of Biological Sciences,Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity,Institute for Basic Science (IBS)

Summary

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1’in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Abstract

Kromatin, ökaryotik DNA’yı paketleyen daha yüksek dereceli bir yapıdır. Kromatin, hücre döngüsü fazına göre ve çevresel uyaranlara yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler genomik bütünlük, epigenetik düzenleme ve replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA metabolik reaksiyonları için gereklidir. Kromatin düzeneği, kromatin dinamiği için çok önemlidir ve histon şaperonları tarafından katalize edilir. Kapsamlı çalışmalara rağmen, histon şaperonlarının kromatin montajını mümkün kıldığı mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Ayrıca, histon şaperonları tarafından düzenlenen nükleozomların küresel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu sorunları ele almak için, bu çalışma, histon şaperonları tarafından nükleozom düzeneğinin moleküler ayrıntılarının araştırılmasını kolaylaştıran DNA perdesi adı verilen benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniğini açıklamaktadır. DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için evrensel bir platform sağlamak üzere lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve toplam iç yansıma floresan mikroskobunu (TIRFM) birleştiren hibrit bir tekniktir. DNA perdesi kullanılarak, Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA + ATPaz olan Abo1’in histon şaperon fonksiyonu araştırılır ve Abo1’in histon düzeneğinin altında yatan moleküler mekanizma ortaya çıkarılır. DNA perdesi, kromatin dinamiklerini incelemek için benzersiz bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Ökaryotik DNA, kromatin 1,2 olarak bilinen daha yüksek dereceli bir yapıda paketlenir. Nükleozom, oktamerik çekirdek histonları 3,4 etrafına sarılmış yaklaşık 147 bp DNA’dan oluşan kromatinin temel birimidir. Kromatin, ökaryotik hücrelerde kritik bir rol oynar; örneğin, kompakt yapı DNA’yı endojen faktörlerden ve dışsal tehditlerdenkorur 5. Kromatin yapısı, hücre siklus fazına ve çevresel uyaranlara göre dinamik olarak değişir ve bu değişiklikler, replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA işlemleri sırasında protein erişimini kontrol eder6. Kromatin dinamiği, genomik stabilite ve epigenetik bilgi için de önemlidir.

Kromatin, histon kuyruğu modifikasyonları ve kromatin yeniden şekillendiriciler, policomb grubu proteinleri ve histon şaperonları7 gibi kromatin düzenleyicileri dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından dinamik olarak düzenlenir. Histon şaperonları, çekirdek histonlarınınbirikmesi veya ayrılması yoluyla nükleozomların birleştirilmesini ve sökülmesini koordine eder 8,9. Histon şaperonlarındaki kusurlar genom kararsızlığına neden olur ve gelişimsel bozukluklara ve kansere neden olur 9,10. Çeşitli histon şaperonları, nükleozomları 9,11,12,13 birleştirmek veya sökmek için ATP hidrolizi gibi kimyasal enerji tüketimine ihtiyaç duymaz. Son zamanlarda araştırmacılar, bromodomain içeren AAA + (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPaz) ATPazların, histon şaperonları 14,15,16,17 olarak kromatin dinamiklerinde rol oynadığını bildirdi. İnsan ATAD2 (ATPase ailesi AAA alanı içeren protein 2), gen ekspresyonunu geliştirmek için kromatin erişilebilirliğini teşvikeder 18. Transkripsiyonel bir yardımcı düzenleyici olarak ATAD2, onkojenik transkripsiyonel faktörlerin14 kromatinini düzenler ve ATAD2’nin aşırı ekspresyonu birçok kanser türünde kötü prognozile ilişkilidir 19. ATAD2’nin Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloğu olan Yta7, kromatin15’teki nükleozom yoğunluğunu azaltır. Buna karşılık, ATAD2’nin Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloğu olan Abo1, nükleozom yoğunluğunuarttırır 16. Benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesi kullanılarak, Abo1’in nükleozom montajına veya sökülmesine katkıda bulunup bulunmadığıele alınmaktadır 17,20.

Geleneksel olarak, biyomoleküllerin biyokimyasal özellikleri, çok sayıda molekülün incelendiği elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) veya ko-immünopresipitasyon (co-IP) gibi toplu deneylerle incelenmiştir ve ortalama özellikleri karakterize edilmiştir21,22. Toplu deneylerde, moleküler alt durumlar, topluluk ortalaması etkisi ile örtülür ve biyomoleküler etkileşimlerin araştırılması kısıtlanır. Buna karşılık, tek moleküllü teknikler, toplu deneylerin sınırlamalarını ortadan kaldırır ve biyomoleküler etkileşimlerin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Özellikle, tek moleküllü görüntüleme teknikleri, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır23. Böyle bir teknik, mikroakışkanlara ve toplam iç yansıma floresan mikroskobuna (TIRFM) dayanan benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesidir24,25. Bir DNA perdesinde, yüzlerce ayrı DNA molekülü, lipid akışkanlığı nedeniyle DNA moleküllerinin iki boyutlu hareketine izin veren lipid çift tabakasına bağlanır. Hidrodinamik akış uygulandığında, DNA molekülleri çift tabaka üzerindeki akış boyunca hareket eder ve hizalandıkları ve gerildikleri bir difüzyon bariyerinde sıkışırlar. DNA, interkalasyon ajanları ile boyanırken, floresan etiketli proteinler enjekte edilir ve TIRFM, protein-DNA etkileşimlerini tek molekül seviyesinde gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılır23. DNA perde platformu, difüzyon, translokasyon ve çarpışma gibi protein hareketlerinin gözlemlenmesini kolaylaştırır 26,27,28. Ayrıca, DNA perdesi, tanımlanmış konumlar, yönelimler ve topolojiler ile DNA üzerinde protein haritalaması için kullanılabilir veya protein ve nükleik asitlerin faz ayrımı çalışmasına uygulanabilir 29,30,31.

Bu çalışmada, DNA perdesi tekniği, spesifik proteinlerin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla şaperonların işlevine kanıt sağlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, DNA perdesi yüksek verimli bir platform olduğundan, istatistiksel güvenilirlik için yeterli miktarda veri toplamayı kolaylaştırır. Burada, S. pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz Abo1’in moleküler rolünü araştırmak için DNA perdesi testinin nasıl yapılacağı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Protocol

1. Akış hücresinin hazırlanması Daha önce yayınlanmış rapor25’i izleyerek nano hendek desenleri içeren temizlenmiş kaynaşmış bir silika lam hazırlayın.Elmas kaplı bir matkap ucu kullanarak temizlenmiş erimiş bir silika slaytta (Şekil 1A) 1 mm çapında iki delik açın (bkz. Malzeme Tablosu). 10 mTorr argon gazı ile DC püskürtme32 ( Malzeme Tablosuna</…

Representative Results

Bu çalışma, DNA perdesi testi için akış hücresi hazırlama prosedürünü açıklar (Şekil 1A). DNA perdesi testi, Abo1 ile DNA üzerinde histon H3-H4 dimer düzeneğinin incelenmesini kolaylaştırdı. İlk olarak, DNA molekülleri interkalasyon boyası olan YOYO-1 ile boyanarak DNA perdesi oluşumu kontrol edildi. Yeşil çizgiler paralel dizilerde gösterildi, bu da YOYO-1’in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalanmış ve gerilmiş DNA moleküllerine in…

Discussion

Tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olarak DNA perdesi, DNA metabolik reaksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır43. DNA perdesi, lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve TIRFM’yi birleştiren hibrit bir sistemdir. Diğer tek moleküllü tekniklerin aksine, DNA perdesi, protein-DNA etkileşimlerinin yüksek verimli gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, DNA perdesi tekniği, diziye özgü ilişki, DNA ile birlikte protein hareketi v…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Güney Kore’deki KAIST’ten Profesör Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. ve Juwon Jang, Ph.D.’nin Abo1 ve Cy5-H3-H4’e verdiği nazik desteği takdir ediyor. Bu çalışma, Ulusal Araştırma Vakfı Hibesi (NRF-2020R1A2B5B01001792), Ulsan Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü’nün okul içi araştırma fonu (1.210115.01) ve Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R022-D1) tarafından desteklenmektedir.

Materials

1 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 301321
1' x 3' fused-silca slide glass G. Finkenbeiner 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti 850375 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE Avanti 870273 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE Avanti 880130 This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302832
6-way sample injection valve IDEX MX series II
950K PMMA All-resist 671.04
Acetone SAMCHUN A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A2383
Aluminum (Al) TASCO, South Korea LT50AI414 Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa Millipore Z648027
Ampicillin Mbcell MB-A4128 Antibiotics
AZ 300 MIF developer Merck 10454110521 Used for removing aluminum
Blade DORCO DN52 12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3) UNIONGAS Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Catalase Sigma C40-1g This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2) UNIONGAS Purity: >99.99%
Clear double-sided tape 3M 313770
D-(+)-glucose Sigma G7528
DC sputter Sorona SRM-120 Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit Eurotool DIB-211.00 Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
Dove-prism Korea Electro-Optics Co. Ltd. 1906-106 Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill Dremel Dremel 3000 Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography Nanobeam Ltd. NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-1KG
Fingertight fittings IDEX F-300 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut IDEX P-235 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL Labogene HC3110 Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase Sigma G2133-50KU This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride Acros Organics 364790025
Hamilton syringe Hamilton Company 80065 This syringe is used for sample injection
Hellmanex III Sigma Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg Cytiva 28-9893-36 Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer Corning PC-420D
Hydrochloric acid Sigma H1759 Used for Tris-HCl
Index matching oil ZEISS 444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching Top Technology Ltd. FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Glentham Life Sciences GC6586-100g Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA NEB N0311
LB broth BD difco 244610 Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32 IDEX P-659 This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate fisher bioreagents BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK) KAYAKU ADVANCED MATERIALS Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2) Nikon Eclipse Ti2 Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip MARIENFELD 101142 22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide DURAN GROUP DU.2355013 Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport IDEX N-333-01
Objective lens Nikon CFI Plan Apochromat VC 60XC WI Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C6060-03 Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
PFA tubing natural IDEX 1512L It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche 11359061001 Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution Cytiva 17-0584-01 Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve IDEX P-732
Sodium acetate Sigma 791741
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa Spectrum laboratories 132660
Streptavidin Thermo Fisher Scientific S888
Sulfur tetralfluoride (SF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
Syringe pump KD Scientific 78-8210
Tetrafluoromethane (CF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
TritonX-100 Sigma T9284
Trizma base Sigma T1503 Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW TOSOH 14715 Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly IDEX P-760 This connects tubings
Urea Sigma U5378
Vacuum oven Jeio Tech OV-11
YOYO-1 Thermo Fisher Scientific Y3601 This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME) Sigma M6250
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596 (2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Génétique. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the ‘601’ sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).

Tags

DNA CurtainSingle-molecule ImagingChromatin DynamicsHistone ChaperonesTIRF MicroscopyBiomolecule InteractionsLambda DNAStreptavidinBiotinylated LipidYOYO-1 DyeMicrofluidic System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J. Y. Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique. J. Vis. Exp. (181), e63501, doi:10.3791/63501 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image