Summary

Un modèle de rongeur induit par le TNBS pour étudier le rôle pathogène du stress mécanique dans la maladie de Crohn

Published: March 01, 2022
doi:

Summary

Le présent protocole décrit le développement d’un modèle de colite semblable à celui de Crohn chez les rongeurs. L’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS et un élargissement mécanique est observé dans le segment proximal de la sténose. Ces changements permettent d’étudier le stress mécanique dans la colite.

Abstract

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) telles que la maladie de Crohn (MC) sont des troubles inflammatoires chroniques du tractus gastro-intestinal affectant environ 20 pour 1 000 000 en Europe et aux États-Unis. La MC se caractérise par une inflammation transmurale, une fibrose intestinale et une sténose luminale. Bien que les thérapies anti-inflammatoires puissent aider à contrôler l’inflammation, elles n’ont aucune efficacité sur la fibrose et la sténose dans la MC. La pathogenèse de la MC n’est pas bien comprise. Les études actuelles se concentrent principalement sur la délimitation des mécanismes de réponse immunitaire intestinale dérégulés. Alors que l’inflammation transmurale associée à la MC, la fibrose intestinale et la sténose luminale représentent toutes un stress mécanique à la paroi intestinale, le rôle du stress mécanique dans la MC n’est pas bien défini. Pour déterminer si le stress mécanique joue un rôle pathogène indépendant dans la MC, un protocole de modèle de colite de type CD induite par TNBS chez les rongeurs a été développé. Ce modèle d’inflammation transmurale et de fibrose induit par le TNBS ressemble aux caractéristiques pathologiques de la MC dans le côlon. Elle est induite par instillation intracolononique de TNBS dans le côlon distal des rats Sprague-Dawley adultes. Dans ce modèle, l’inflammation transmurale entraîne une sténose au site d’instillation du TNBS (site I). Une distension mécanique est observée dans la portion proximale au site d’instillation (site P), représentant un stress mécanique mais pas d’inflammation visible. La partie colique distale à l’inflammation (site D) ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements distinctifs de l’expression des gènes, de la réponse immunitaire, de la fibrose et de la croissance musculaire lisse à différents sites (P, I et D) ont été observés, soulignant un impact profond du stress mécanique. Par conséquent, ce modèle de colite de type CD nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogènes de la MC, en particulier le rôle du stress mécanique et de l’expression des gènes induits par le stress mécanique dans la dérégulation immunitaire, la fibrose intestinale et le remodelage tissulaire dans la MC.

Introduction

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), y compris la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC), se caractérisent par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal (GI). Il affecte ~ 1-2 millions d’Américains1. Les coûts annuels estimés des soins des MII aux États-Unis sont de 11,8 milliards de dollars. Contrairement à la CO, la MC est caractérisée par une inflammation transmurale et la formation de sténoses 2,3. La formation de sténoses (sténose) survient chez jusqu’à 70 % des patients atteints de la MC3 et peut être causée par une inflammation transmurale (sténose inflammatoire) ou une fibrose intestinale (sténose fibrotique)4,5. La fibrose intestinale est caractérisée par un dépôt excessif de collagène et d’autres matrices extracellulaires (ECM) avec des cellules musculaires lisses (SMC) comme l’un des principaux types de cellules mésenchymateuses impliquées dans le processus 3,4. L’hyperplasie musculaire lisse associée à l’hypertrophie est un autre changement histologique important de la sténose fibrotique dans laCD 6. Bien que la formation de sténoses dans la MC soit associée à une inflammation chronique, aucun traitement anti-inflammatoire n’est efficace, à l’exception du traitement chirurgical 2,6. Cependant, les récidives post-opératoires sont presque de 100%, avec suffisamment de temps 2,7. En tant que réponse inflammatoire, la fibrose et l’hyperplasie SMC peuvent également se développer dans des conditions non inflammatoires (c.-à-d. occlusion intestinale) dans l’intestin 8,9; on pense que des mécanismes dépendants de l’inflammation et indépendants sont impliqués dans la formation desténoses 3,4. Étant donné que des recherches approfondies sur les mécanismes dépendants de l’inflammation ne se sont pas traduites par un traitement efficace pour la formation de sténoses, des études sur le rôle possible des mécanismes indépendants de l’inflammation dans la fibrose intestinale sont nécessaires.

En tant que facteur non inflammatoire, le stress mécanique (SEP) associé à l’œdème, à l’infiltration de cellules inflammatoires, à la déformation tissulaire, à la fibrose et à la sténose 10,11,12,13 est couramment rencontré dans les MII, en particulier la MC, qui se caractérise par une inflammation transmurale. Le stress mécanique est le plus remarquable dans la CD sténotique, où la sténose (inflammatoire ou fibrotique) dans le site de l’inflammation présente un stress mécanique dans le tissu local et conduit à une distension de la lumière dans le segment proximal au site d’obstruction10,14. Des études in vitro antérieures ont démontré que le stress mécanique modifie l’expression génique de médiateurs inflammatoires spécifiques (c.-à-d. COX-2, IL-6)8,14,15 et les facteurs de croissance (c.-à-d. TGF-β) dans les tissus gastro-intestinaux, en particulier les cellules musculaires lisses intestinales (SMC)16. Des études récentes ont également révélé que l’expression de médiateurs pro-fibrotiques spécifiques tels que le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) est très sensible au stress mécanique17,18. On a émis l’hypothèse que le stress mécanique pourrait jouer un rôle pathogène indépendant dans l’inflammation, la fibrose et le remodelage des tissus associés à la MC. Cependant, l’importance pathogène du stress mécanique dans l’inflammation intestinale, la fibrose et l’hyperplasie des muscles lisses dans la MC reste largement inexplorée. Cela peut être dû en partie au fait que l’inflammation est un processus plus visible et mieux étudié que le stress mécanique. Plus important encore, il n’y a pas eu de modèle animal bien défini de MII pour distinguer l’effet du stress mécanique de celui de l’inflammation.

Les travaux actuels décrivent un modèle rongeur de colite de type Crohn induite par injection intracolonique de réactif haptène acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique (TNBS)19,20, qui pourrait servir à étudier le rôle du stress mécanique dans la MC. Il a été constaté que l’instillation de TNBS induisait une inflammation transmurale localisée (~ 2 cm de longueur) avec rétrécissement de la lumière (sténose) dans le côlon distal. La sténose entraîne une distension intestinale marquée (stress mécanique)14,15 mais une inflammation non visible dans le segment colique proximal du site d’instillation. Au contraire, le segment du côlon distal au site de la sténose ne présente ni inflammation ni stress mécanique. Des changements significatifs spécifiques au site dans l’expression des gènes, l’inflammation, la fibrose et l’hyperplasie SMC ont été observés dans les trois sites différents. Les résultats suggèrent que le stress mécanique, en particulier l’expression génétique induite par le stress mécanique, peut jouer un rôle essentiel dans le développement de la fibrose et de l’hyperplasie dans la colite de Crohn.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la branche médicale de l’Université du Texas (#0907051C). Des rats Sprague-Dawley mâles ou femelles, âgés d’environ 8 à 9 semaines, ont été utilisés pour l’étude. 1. Préparation des animaux Jeûnez les rats pendant 24 heures et traitez-les avec un laxatif (nettoyant pour l’intestin, voir tableau des matériaux…

Representative Results

Vue macroscopique de la colite de type Crohn induite par l’instillation intracolique du TNBSComme le montre la figure 1, l’instillation intracolonique de TNBS chez le rat a induit une inflammation transmurale localisée (~2 cm de longueur) avec une paroi intestinale épaissie et une lumière rétrécie (sténose) dans le site d’instillation dans le côlon distal (figure 1A). Le site d’instillation du TNBS est appelé site I. En raiso…

Discussion

La colite induite par le TNBS a été introduite en 1989 et a été utilisée comme modèle expérimental de la maladie de Crohn depuis lors 19,20,23. Les caractéristiques importantes de ce modèle chez les rongeurs comprennent le développement d’une inflammation transmurale qui ressemble beaucoup aux lésions histopathologiques développées dans la maladie de Crohn humaine19,20<sup class=…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu en partie par des subventions des NIH (R01 DK124611 à XZS) et du département de la Défense des États-Unis (W81XWH-20-1-0681 à XZS). Le travail d’histologie a été réalisé avec l’aide du laboratoire de pathologie chirurgicale de l’UTMB.

Materials

ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers
QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

References

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Citer Cet Article
Geesala, R., Lin, Y., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn’s Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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