Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

La retina neurale è un tessuto molto organizzato che presenta strati neuronali ben definiti. In questi, i neuroni (cellule gangliari, amacrine, bipolari, orizzontali e fotorecettori) sono interconnessi tra loro e anche con cellule gliali di Müller (MMC) e astrociti, portando a un’adeguata fototrasduzione ed elaborazione delle informazioni visive ^1,2. Le MGC sono note per avere un ruolo importante nel mantenimento dell’omeostasi retinica perché attraversano l’intera sezione retinica e, quindi, possono interagire con tutti i tipi di cellule che modulano molteplici processi protettivi. È stato riportato che le MGC hanno diverse funzioni importanti per il mantenimento e la sopravvivenza dei neuroni retinici, tra cui la glicolisi per fornire energia ai neuroni, la rimozione dei rifiuti neuronali, il riciclaggio dei neurotrasmettitori e il rilascio di fattori neurotrofici, tra gli altri ^3,4,5.

D’altra parte, l’infiammazione, lo stress ossidativo e nitrosativo sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione di molte malattie umane, comprese le retinopatie ^{6,7,8,9,10,11}. L’equilibrio redox nelle cellule dipende da una stretta regolazione dei livelli di ROS. I ROS sono costantemente generati in condizioni fisiologiche come risultato della respirazione aerobica principalmente. I principali membri della famiglia ROS includono radicali liberi reattivi come l’anione superossido (O_2͘͘͘͘^•−), radicali idrossilici (^•OH), vari perossidi (ROOR′), idroperossidi (ROOH) e il perossido di idrogeno senza radicali (H₂O₂)^12,13. Negli ultimi anni, è diventato evidente che i ROS svolgono un importante ruolo di segnalazione nelle cellule controllando i processi essenziali. Le MGC hanno una forte difesa antiossidante mediante l’attivazione del fattore nucleare trascrizionale eritroide-2-correlato al fattore 2 (Nrf2) e la successiva espressione di proteine antiossidanti per eliminare l’eccessiva produzione di ROS in condizioni patologiche 14,15,16. Quando le cellule perdono il loro equilibrio redox a causa di una produzione esagerata di ROS o di una capacità difettosa di rimuovere ROS, l’accumulo di stress ossidativo promuove modifiche dannose in proteine, lipidi e DNA, portando a stress cellulare o morte. L’aumento del sistema di difesa antiossidante retinico migliora la risoluzione e la prevenzione delle retinopatie, come ROP e RD ^{17,18,19,20,21,22,23,24}. Pertanto, la misurazione della produzione ros in tempo reale è uno strumento potente e utile.

Esistono diversi metodi per misurare la produzione di ROS o lo stress ossidativo nelle cellule. Tra queste, la sonda 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) è una delle tecniche più utilizzate per quantificare direttamente lo stato redox di una cellula 25,26,27,28. Questa sonda è lipofila e non fluorescente. La diffusione di questa sonda attraverso la membrana cellulare consente la sua scissione da parte delle esterasi intracellulari ai due legami estere, producendo un prodotto relativamente polare e impermeabile alla membrana cellulare, la 2′,7′-diclorofluoresceina (H₂DCF). Questa molecola non fluorescente si accumula intracellulare e la successiva ossidazione da parte di ROS produce il prodotto altamente fluorescente DCF. L’ossidazione della sonda è il prodotto dell’azione di più tipi di ROS (perossinitrito, radicali idrossilici, ossido nitrico o perossidi), che possono essere rilevati mediante citometria a flusso o microscopia confocale (emissione a 530 nm ed eccitazione a 485 nm). Il limite di questa tecnica è che il superossido e il perossido di idrogeno non reagiscono fortemente con H₂DCF^25,29. In questo articolo, utilizziamo la sonda DCFH-DA per misurare e quantificare i ROS mediante citometria a flusso. Per questo motivo, induciamo la produzione di ROS stimolando mgC con induttore ROS, A o B, prima di caricare le cellule con la sonda fluorescente. Inoltre, utilizziamo un composto antiossidante. Infine, mostriamo dati rappresentativi e affidabili ottenuti utilizzando questo protocollo.