Kvantificering af reaktive iltarter ved anvendelse af 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetafet sonde og flowcytometri i Müller glialceller

Den neurale nethinde er et meget organiseret væv, der præsenterer veldefinerede neuronale lag. I disse er neuroner (ganglion, amakrine, bipolære, vandrette og fotoreceptorceller) forbundet med hinanden og også med Müller glialceller (MMC’er) og astrocytter, hvilket fører til tilstrækkelig fototransduktion og behandling af visuel information ^1,2. MMC’er er kendt for at have en vigtig rolle i opretholdelsen af retinal homeostase, fordi de krydser hele retinalsektionen, og dermed kan de interagere med alle celletyper, der modulerer flere beskyttelsesprocesser. Det er blevet rapporteret, at MMC’er har flere vigtige funktioner til vedligeholdelse og overlevelse af retinale neuroner, herunder glykolyse for at give energi til neuroner, fjernelse af neuronalt affald, genbrug af neurotransmittere og frigivelse af neurotrofiske faktorer, blandt andre ^3,4,5.

På den anden side er inflammation, oxidativ og nitrosativ stress involveret i patogenesen og progressionen af mange menneskelige sygdomme, herunder retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoxbalancen i celler afhænger af tæt regulering af ROS-niveauer. ROS genereres konstant under fysiologiske forhold som følge af aerob respiration hovedsageligt. De vigtigste medlemmer af ROS-familien omfatter reaktive frie radikaler såsom superoxidanionen (_O2͘͘͘͘^•−), hydroxylradikaler (^•OH), forskellige peroxider (ROOR′), hydroperoxider (ROOH) og det ikke-radikale hydrogenperoxid (_H202)^12,13. I de senere år er det blevet tydeligt, at ROS spiller en vigtig signalrolle i cellerne ved at kontrollere væsentlige processer. MMC’er har et stærkt antioxidantforsvar ved aktivering af den transkriptionelle nukleare faktor erythroid-2-relateret faktor 2 (Nrf2) og den efterfølgende ekspression af antioxidantproteiner for at eliminere overdreven produktion af ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellerne mister deres redoxbalance på grund af en overdreven produktion af ROS eller en defekt evne til at fjerne ROS, fremmer akkumuleringen af oxidativ stress skadelige modifikationer i proteiner, lipider og DNA, hvilket fører til cellulær stress eller død. Forøgelsen af retinal antioxidantforsvarssystemet forbedrer opløsningen og forebyggelsen af retinopatier, såsom ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling af ROS-produktion i realtid et kraftfuldt og nyttigt værktøj.

Der er flere metoder til måling af ROS-produktion eller oxidativ stress i celler. Blandt disse er 2′,7′-dichlorfluoresceindiacetate (DCFH-DA) sonde en af de mest anvendte teknikker til direkte kvantificering af redoxtilstanden for en celle 25,26,27,28. Denne sonde er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusion af denne sonde over cellemembranen tillader dens spaltning ved intracellulære esteraser ved de to esterbindinger, hvilket producerer et relativt polært og cellemembran-uigennemtrængeligt produkt, 2′,7′-dichlorfluorescein (_H2DCF). Dette ikke-fluorescerende molekyle akkumuleres intracellulært, og efterfølgende oxidation med ROS giver det stærkt fluorescerende produkt DCF. Oxidationen af sonden er produktet af virkningen af flere typer ROS (peroxynitrit, hydroxylradikaler, nitrogenoxid eller peroxider), som kan detekteres ved flowcytometri eller konfokalmikroskopi (emission ved 530 nm og excitation ved 485 nm). Begrænsningen af denne teknik er, at superoxid og hydrogenperoxid ikke reagerer stærkt med_H2DCF ^25,29. I denne artikel bruger vi DCFH-DA-sonde til at måle og kvantificere ROS ved flowcytometri. Af den grund inducerer vi ROS-produktion ved at stimulere MMC’er med ROS-induktor, A eller B, inden cellerne fyldes med den fluorescerende sonde. Derudover bruger vi en antioxidantforbindelse. Endelig viser vi repræsentative og pålidelige data opnået ved hjælp af denne protokol.