豚腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1タンパク質の抽出および精製
Summary
このプロトコールは、ブタ腎臓およびマウス肝臓からフマリアセトアセテート加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)を抽出する方法を記載する。列挙された方法は、目的の他のタンパク質に適合させ、他の組織に対して改変してもよい。
Abstract
フマリアセト酢酸加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)は、真核生物においてFAHスーパーファミリーの最初の同定されたメンバーであり、ミトコンドリアにおいてオキサロ酢酸デカルボキシラーゼとして作用する。この記事では、豚の腎臓およびマウス肝臓からFAHD1を抽出および精製するための一連の方法を提示する。対象となる方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によるイオン交換クロマトグラフィー、FPLCによる分取および分析ゲルろ過、およびプロテオミクスアプローチです。全タンパク質抽出後、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーを探索し、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いた逐次戦略 を介して FAHD1を抽出した。この代表的なアプローチは、目的の他のタンパク質(有意なレベルで発現)に適合させ、他の組織について改変してもよい。組織から精製されたタンパク質は、高品質の抗体、および/または強力で特異的な薬理学的阻害剤の開発をサポートし得る。
Introduction
真核生物FAHドメイン含有タンパク質1(FAHD1)は、二官能性オキサロ酢酸(OAA)デカルボキシラーゼ(ODx)1およびアシルピルビン酸加水分解酵素(ApH)2として作用する。それはミトコンドリア2に局在し、酵素1、2、3、4、5、6の広範なFAHスーパーファミリーに属する。そのApH活性はわずかな関連性しかないが、FAHD1のODx活性はTCAサイクルフラックス1、7、8、9の調節に関与している。OAAは、トリカルボン酸サイクルにおける中央クエン酸合成酵素反応に必要とされるだけでなく、電子伝達系の一部として、およびカタプレロティック代謝産物としてコハク酸デヒドロゲナーゼの競合阻害剤としても作用する。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるFAHD1遺伝子発現のダウンレギュレーションは、解糖系への付随的な切り替えに関連する細胞増殖速度10の有意な低下、およびミトコンドリア膜電位の有意な阻害をもたらした。作業モデルは、ミトコンドリア機能障害関連老化(MiDAS)11様表現型8を指し、ミトコンドリアOAAレベルはFAHD1活性1,8,9によって厳密に調節される。
組換えタンパク質は、組織からではなく細菌12から発現および精製を介して得る方が容易である。しかし、細菌で発現されるタンパク質は、翻訳後修飾の欠如の可能性によって偏っているか、単に問題となる可能性がある(すなわち、プラスミド喪失、細菌ストレス応答、歪んだ/未形成のジスルフィド結合、分泌不良、タンパク質凝集、タンパク質分解的切断など)。特定の用途では、タンパク質は、そのような修飾を含むため、および/または起こり得る人工物を排除するために、細胞溶解物または組織から取得する必要がある。組織から精製されたタンパク質は、FAHD113などの選択された酵素に対する高品質の抗体、および/または強力で特異的な薬理学的阻害剤の開発を支持する。
この原稿は、ブタ腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1の抽出および精製のための一連の方法を提示する。記載されている方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を必要としますが、それ以外の場合は一般的な実験装置を使用します。代替的な方法は、他の場所で見出すことができる14、15、16、17。全タンパク質抽出後、提案されたプロトコルには試験段階が含まれ、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーのサブプロトコルが議論される(図1)。これらのサブプロトコールを定義した後、目的のタンパク質は、イオン交換およびFPLCによるサイズ排除クロマトグラフィーを用いた逐次戦略を介して抽出される。これらのガイドラインに基づいて、最終プロトコールは、関心のある他のタンパク質に対して個別に適合され得る。
図 1: このプロトコルの全体的な戦略 上から下へ:タンパク質は組織から抽出されます。組織ホモジネートを調製し、遠心分離し、濾過した。上清およびペレット由来サンプルのペアごとに、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィー(FPLC)の試験を実施して、最適な条件をプローブする必要があります。これらのサブプロトコールを確立した後、タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および反復サイズ排除クロマトグラフィー(FPLC)の逐次手順 を介して 、様々なpHおよび塩濃度で抽出され得る。すべてのステップはウェスタンブロットによって制御される必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの重要なステップ
タンパク質の取り扱いに関する一般的なガイドラインに従うことは、氷上や適度なpHおよび塩条件下での作業など、不可欠です。プロテアーゼ阻害剤の使用は、この方法にとって有益であるが、プロテアソーム阻害剤の使用は強く推奨される。サンプルを凍結および融解すると、常にタンパク質沈殿(少なくとも部分的に)が生じる可能性があるため…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Ayse ÖztürkとEva Albertiniによる技術支援に非常に感謝しています。肝臓組織の生成に用いたマウスは、大学-Dozの監督下で維持した。Pidder Jansen-Dürr博士(インスブルック大学生物医学老化研究所、Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
References
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -. W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily – A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- . Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011)
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- . Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022)
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
