CD1 wild-type muizen werden gehuisvest volgens de Europese regelgeving, met een standaard dag- en nachtcyclus met voedsel en water ad libitum. CD1-vrouwtjes werden ‘s nachts gepaard met CD1-mannetjes en vaginale pluggen werden ‘s ochtends gecontroleerd (E0.3). Alleen zwangere vrouwen werden gebruikt voor de injectie. Ethische goedkeuring voor alle hier beschreven experimenten werd verleend door de Zweedse Raad van Landbouw (Jordbruksverket). 1. Bereiding van glazen naalden: naaldtrekken en malen OPMERKING: Hoewel voorgemalen naalden kunnen worden gekocht, maakt het trekken van naalden in eigen huis eenvoudige aanpassingen van naaldlengte, boring en schuine hoek mogelijk. Monteer een glazen capillair in de micropipette/capillaire trekker. Gebruik de volgende instellingen met behulp van de opgegeven apparatuur (zie de tabel met materialen): warmte 580 eenheden; snelheid 140 eenheden; tijd 200 eenheden; druk 500-800 eenheden.OPMERKING: De eenheden van verschillende parameters worden gedefinieerd door de capillaire trekker. Eenheden kunnen variëren voor verschillende apparatuur. Druk op Pull om het capillair uit elkaar te trekken en twee glazen haarvaten met taps toelopende uiteinden te produceren.OPMERKING: Na het trekken zijn de uiteinden van de twee glazen haarvaten dichtgesmolten vanwege de hoge temperatuur van de micropipettetrekker. Knip de punt met een chirurgische schaar om een naaldlengte van ~ 7 mm te verkrijgen (gemeten vanaf waar de naald begint taps toe te lopen) (figuur 1A).OPMERKING: Voor E7.5-injecties is een lange en fijne naald van cruciaal belang, omdat het injectiegebied erg klein en delicaat is. Korte en breedborende naalden zullen leiden tot embryonale sterfgevallen. Maal de punt van de gesneden naald tot een scherpe schuine kant (figuur 1C-F).Maal de naald onder een hoek van 20° bij maximale snelheid gedurende ten minste 30-45 minuten.OPMERKING: Ultrapuur water wordt toegevoegd aan de slijpplaat om als smeermiddel te fungeren, wrijving / temperatuur te verminderen en glasdeeltjes weg te spoelen (figuur 1B). Overtollige vloeistof kan de molen echter vertragen. Zorg ervoor dat de punt van de naald (figuur 1C) het oppervlak van de slijpplaat raakt (figuur 1D) maar niet buigt (figuur 1E).OPMERKING: Gebogen slijpen resulteert in een lange en fragiele naaldpunt met een onjuiste schuine hoek, die gemakkelijk kan breken tijdens injectie. Brekende naalden kunnen het embryo beschadigen en moeten worden vervangen door een intacte naald. Een correct geslepen punt is weergegeven in figuur 1F,G. Na het slijpen zal de resulterende naaldboring naar verwachting een binnendiameter (ID) van ~ 15 μm en een buitendiameter (OD) van ~ 35 μm hebben (figuur 1G). Vul een spuit van 1 ml met minerale olie en bevestig een naald van 27 G. Verwijder de naalddop en steek de naald van de spuit in het nieuw gemalen glazen capillair. Injecteer minerale olie totdat de olie uit de capillaire punt druipt. Blijf injecteren terwijl u de naald van 27 G optrekt totdat de capillaire naald is gevuld met minerale olie, waarna de naald van de spuit kan worden verwijderd. Bewaar met grond en minerale olie gevulde naalden in een gesloten omgeving om schade en stofophoping te voorkomen. Plaats voor opslag twee rollen modelleerklei in een gewone petrischaal om als houders te dienen (figuur 1H). Plaats de naalden voorzichtig op de klei en plaats ze ver uit elkaar voor het gemakkelijk ophalen van de naalden.OPMERKING: Omdat naaldbereiding tijdrovend is, is het het beste om naalden ten minste één dag voorafgaand aan injecties te bereiden. Gooi de naalden na maximaal twee nesten weg, omdat ze bot worden. Bereid altijd back-up naalden voor in geval van naaldbeschadiging tijdens de bereiding of injectie. Figuur 1: Naaldvoorbereiding voor E7.5 amniotische holte-injecties. (A) Representatieve voorbeelden van een getrokken maar ongesneden glazen capillaire naald (links), een capillaire naald gesneden op de optimale lengte voor E7.5-injecties (midden) en een capillaire snede te kort (rechts). (B) De molen met gelijkmatige dekking van water, die klaar is voor naaldslijpen. (C-F) Representatieve voorbeelden van verschillende naaldpunten. C) gesneden maar ongemalen naaldpunt gemonteerd in een molen; D) ideale slijppositie waarbij de punt van de naald de molen net raakt; E) naald te ver neergelaten en gebogen tijdens het maalproces; (F) een ideale geslepen naaldpunt voor E7.5 AC-injecties. (G) Een geslepen naaldpunt met de boring met een binnendiameter van ~ 15 μm en een buitendiameter van ~ 35 μm, die geschikt is voor E7.5 AC-injectie. De naaldboring wordt weergegeven als stippellijnen. Buitendiameter aangeduid met rode pijlpunten; binnendiameter aangeduid met blauwe pijlpunten. (H) Naaldopslag: Petrischaal gevuld met getrokken en gemalen naalden. Twee rijen boetseerklei dienen als houders. OPMERKING: Voor de oculaire micrometer in C, F, G is 1 cm verdeeld in 100 toonhoogten; het doel is 3x; daarom 1 pek= 10.000 μm/(100 × 3) ≈ 33,4 μm. Afkortingen: AC = vruchtwaterholte; ID = inwendige diameter; OD = buitendiameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Dag voor injectie: bereid de bank voor op echografie-verificatie van de zwangerschap OPMERKING: Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een geventileerde Biosafety Level 2 (BSL 2) bank bij het werken met lentivirus. Echografie-verificatie van zwangerschap kan worden uitgevoerd op een geventileerde bank. Schakel het echoapparaat, de verwarmingstafel en de O2-voeding voor de isofluraanpomp in (kan per apparaat verschillen).OPMERKING: Controleer het isofluraansysteem om er zeker van te zijn dat er geen isofluraan in de lucht lekt. Plaats een lege afvalzak (vastgeplakt aan de binnenwand voor gemakkelijke toegang), ontharingscrème, steriel verpakte wattenstaafjes, water, tissuepapier en chirurgische tape in de BSL 2-bank. Bereid vier stukken chirurgische tape (~ 7 cm lang) voor om de ledematen van de muis vast te zetten tijdens de echografie van de zwangerschap. 3. Echografie om de zwangerschap te bevestigen OPMERKING: Deze stap kan de dag vóór E7.5-injecties worden uitgevoerd, op E6.5. Zie de discussie voor meer informatie over de controle op de zwangerschapsduur. Plaats de tijdgebonden vrouwelijke muis in de inductiekamer. Schakel de gasstroom in met een zuurstofstroom van ~ 2,1 LPM en een initiële dosis van 3-4% isofluraan om anesthesie te induceren. Controleer of het vrouwtje volledig verdoofd is door de pootreflex te controleren. Als de pootreflex afwezig is, verlaag dan isofluraan tot 1,5-2%.OPMERKING: Het duurt ongeveer 3 minuten om anesthesie te induceren. Schakel de gasstroom van de inductiekamer naar de neuskegel van de verwarmingstafel. Plaats het verdoofde vrouwtje in rugligging (buik omhoog) op de verwarmingstafel en plaats de snuit in de bevestigde neuskegel om te zorgen voor behoud van anesthesie tijdens de echografie van de zwangerschap. Bevestig alle vier de poten aan de tafel met de voorbereide stukjes chirurgische tape zonder het lichaam van de vrouw uit te rekken of de snorharen te vangen. Breng een hoeveelheid ontharingscrème ter grootte van een erwt aan op de onderbuik. Verdeel met een wattenstaafje de crème over de onderbuik (een vierkant van ~ 3 x 3 cm) en masseer het zachtjes in door het wattenstaafje heen en weer te rollen. Zodra de vacht begint los te komen van de huid, bevochtig je een tissuepapier en verwijder je de crème en de vacht. Reinig het ontbonte gebied met vochtig vloeipapier totdat alle crème en haar weg zijn. Droog de huid. Breng een hoeveelheid ultrasone gel ter grootte van een pruim aan op het geschoren gebied en ga verder met het identificeren van de baarmoeder met behulp van echografie door een van de volgende drie benaderingen.Om dit handmatig te doen, houdt u de ultrasone sonde in de ultrasone gel en verplaatst u de sonde om de baarmoeder te vinden. Voor semimanuele benadering # 1 plaatst u de ultrasone sonde (bevestigd aan het relingsysteem) boven de vrouwelijke buik door een deel van de rail langs het x-vlak los te maken en te verplaatsen. Laat de ultrasone sonde in de gel zakken (z-plane) en scan door de onderbuik (y-plane) (figuur 2A). Voor semimanuele benadering # 2, laat u de ultrasone sonde (bevestigd aan het relingsysteem) in de gel zakken om de onderbuik in beeld te brengen. Houd de ultrasone sonde stationair tijdens het proces en verplaats de verwarmingstafel met de bevestigde wielen langs x- en/of y-vlakken (figuur 2B).OPMERKING: In deze vroege embryonale stadia kunnen inwendige organen, bijvoorbeeld de darm, lijken op de baarmoeder in echografie. Hoewel embryo’s en decidua verschijnen als een opeenvolging van bollen (vergelijkbaar met kralen langs een ketting), heeft de darm het uiterlijk van een doorlopende buis. De connectiviteit van luminale ruimten (afzonderlijke bollen versus een continue buis) kan worden beoordeeld door heen en weer te scannen door de structuur van belang om te bepalen of de structuur een discrete bol (embryo / decidua) (figuur 2C) of een continue buis (darm) is (figuur 2D). In dit stadium is het niet nodig om het aantal embryo’s te registreren; het volstaat om hun aan- of afwezigheid te bevestigen. Zodra de zwangerschapsstatus is bepaald, tilt u de ultrasone sonde weg van de buik en veegt u de onderbuik schoon met vochtig tissuepapier om de ultrasone gel te verwijderen. Schakel de isofluraanpomp uit en verwijder de chirurgische tape om de poten los te maken. Plaats het vrouwtje in buikligging (buik naar beneden) in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 40 °C. Houd het vrouwtje nauwlettend in de gaten totdat ze weer bij bewustzijn komt, wat 2-6 minuten duurt.OPMERKING: Zorg ervoor dat de echografiecontrole voor één vrouw <10 minuten is om de blootstelling aan isofluraan te minimaliseren. Verwijder alle materialen en afval en reinig alle oppervlakken met 70% ethanol. Veeg alle overgebleven ultrasone gel van de ultrasone sonde af met een droog, zacht en pluisvrij papieren zakdoekje. Schakel het echoapparaat, de geventileerde bank / BSL2-bank, de verwarmingstafel en de O2-voeding uit. 4. Echografiecontrole voor embryostadiëring OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd vóór de operatie en dient om de zwangere vrouwen te stratificeren op basis van hun AC-maten. Deze stap is cruciaal op E7.5 wanneer het doel is om het zich ontwikkelende CZS te richten. In dit vroege stadium van ontwikkeling heeft een verschil van enkele uren in ontwikkeling een aanzienlijke invloed op de grootte van de AC en de progressie van neurulatie. Verdoof de eerste zwangere vrouwelijke muis volgens de stappen in stap 3.1-3.5. Plaats en fixeer het vrouwtje op de tafel zoals beschreven in stap 3.6. Breng een hoeveelheid ultrasone gel ter grootte van een pruim aan op de geschoren buik en laat de ultrasone sonde zakken om de onderbuik van het vrouwtje in beeld te brengen.OPMERKING: Deze stap gaat ervan uit dat het vrouwtje de vorige dag door echografie is geïnspecteerd voor zwangerschap en al vacht op de buik heeft laten verwijderen. Als dit niet het geval is, moet de vacht worden verwijderd voordat de ultrasone gel wordt toegevoegd volgens de stappen 3.7-3.8. Bij E7.5 zijn de baarmoeder en deciduas groter en gemakkelijker te onderscheiden van inwendige organen. Bovendien is de AC groter en kan worden onderscheiden van de exocelomische holte (ExC). Scan de linker- en rechterhoorntjes van de baarmoeder zo volledig mogelijk.OPMERKING: Sommige embryo’s liggen dieper in het lichaam van het vrouwtje en kunnen worden gemist. Noteer het aantal en de stadia van de embryo’s. Noteer het aantal vruchtwaterholtes van ideale grootte, aanvaardbare holtes en deciduas zonder holte (figuur 2E-G). Ensceneer alle zwangerschappen en rangschik ze dienovereenkomstig. Injecteer vrouwen met een meerderheid van de ideale grootte AC’s onmiddellijk na de echografiecontrole (stap 4.4) volgens de instructies in stap 4.5-4.7. Voor vrouwen met een meerderheid van acceptabele (waarbij de exocelomische en vruchtwaterholtes nog niet duidelijk in twee holtes zijn verdeeld) of afwezige holtes, stel de injectie uit en voer ze na een paar uur opnieuw in scène. Als de meeste holtes nog steeds te klein zijn, stel de injecties dan 10-12 uur uit. Figuur 2: Inspectie en stadiëring van vruchtwaterholtes tijdens echografie-controle. (A) Overzicht van het railsysteem met bijgevoegde ultrasone sonde, nano-injector en verwarmingstafel. De ultrasone sonde kan worden verplaatst in x-, y- en z-vlakken om een optimale uitlijning met de vrouwelijke buik of de AC’s te bereiken. (B) Verwarmingstafel kan via twee wielen in x- en/of y-vlakken worden verplaatst om nauwkeurig scannen en beoordelen van de AC’s mogelijk te maken, terwijl de ultrasone sonde statisch kan blijven. (C) Representatieve echografiebeelden van E6.5 deciduas in de vrouwelijke buik tijdens echografiecontrole om de zwangerschap te bevestigen (witte stippelvormige contouren). Er hebben zich op dit punt geen holtes gevormd; soms is echter de ectoplacentale kegel (witte sterretjes) zichtbaar. Deciduas zijn te herkennen aan hun bolvorm en onderscheiden van de darm, die verschijnt als één doorlopende buis. (D) Representatieve beeldsequentie van de dunne darm (wit gestippelde contouren), die continu door de onderbuik wordt gescand. (E-G) Representatieve echografiebeelden tijdens caviteitsstadiëring voorafgaand aan E7.5-injecties. De vruchtwater- en exocelomische holtes hebben zich gevormd en worden gescheiden door het amnion. De ectoplacentale kegel dient als de belangrijkste bloedtoevoer en verschijnt als een lichtpuntje in de echografie. De AC is het meest distal van de ectoplacentale kegel. (E) Ideale ACs lijken groter dan de exocelomische holte, terwijl middelgrote holtes kleiner lijken (F). Als er geen gaatjes zichtbaar zijn (G), betekent dit dat het embryo is geresorbeerd of nog niet E7.5 heeft bereikt. Schaalstaven = 1 mm. Afkortingen: A = Amnion; AC = vruchtwaterholte; ExC = Exocelomische Holte; EC = Ectoplacentale kegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Dag van injectie: bereid de BSL2-bank voor op een operatie Lijm een stuk elastisch membraan op de ronde, centrale opening van een in de handel verkrijgbare, aangepaste petrischaal. Zorg ervoor dat het membraan goed is bevestigd aan de petrischaal om lekkage te voorkomen.OPMERKING: Als de schaal lek raakt of niet goed is gelijmd, kunnen de randen van het elastische membraan verder worden vastgezet met ducttape. Maak een 1-1,5 cm lange incisie in het midden van het elastische membraan. Schakel het ultrageluidsapparaat, de BSL2-bank, de verwarmingsplaat, de O2-voeding voor de isofluraanpomp en de glazen kraalsterilisator (ingesteld op 300 °C) in. Plaats in de BSL2-bank een lege afvalzak (vastgeplakt aan de binnenmuur voor gemakkelijke toegang); steriel verpakte wattenstaafjes (gebruik een nieuwe voor elke operatie / elke vrouw); chirurgische hulpmiddelen (schaar, pincet, clips, hechting) en chirurgische tape; een volle fles fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur, een lege fles voor afvalinzameling en een pipet van 25 ml; een petrischaal met elastisch membraan voor chirurgie; het deksel van de petrischaal met een stuk parafilm van 2 x 2-3 x 3 cm dat met een druppel water aan het deksel is bevestigd; modelleerklei: 4 grotere ballen of kubussen (~ 3 x 3 x 3 cm3) en een cilindrisch stuk (~ 4 x 1 cm); een spuit met pijnstillend middel (bijv. buprenorfine, 0,05-0,1 mg/kg lichaamsgewicht) en ooggelNOOT: De ballen (of blokjes) van modelleerklei dienen als “voeten” of standaards/houders voor de petrischaal zodra de schaal bovenop de buik van het vrouwtje is geplaatst. Het cilindrische stuk klei zet de embryo’s in de schaal vast. Als er meer dan één oplossing wordt geïnjecteerd of als de naald tijdens injecties moet worden bijgevuld, kan hetzelfde stuk parafilm worden gebruikt als oplossingen uit elkaar kunnen worden geplaatst. 6. Naald laden Veeg overtollige minerale olie af met tissuepapier voor een betere grip.OPMERKING: Reinig altijd uit de buurt van de punt om schade of letsel te voorkomen. Zorg ervoor dat alle componenten (één afdichtende O-ring, één afstandhouder en één pakking aan de voorkant die zich onder de spantang bevindt, figuur 3A) in de juiste richting zijn geïnstalleerd (figuur 3B, spantang verwijderd voor visualisatie) om de capillaire naald op zijn plaats te houden en een luchtdichte verbinding te creëren, waardoor bellenvorming wordt vermeden bij het opschuiven of intrekken van de metalen zuiger in de naald. Zorg ervoor dat de metalen zuiger van de nanoinjector volledig is ingetrokken. Controleer dit door op Fill te drukken en wacht op een dubbele pieptoon die aangeeft dat de zuiger volledig is ingetrokken. Met de spantang bevestigd maar iets losgemaakt (45-90 graden losgeschroefd), schuift u de glazen naald op de metalen zuiger en duwt u de capillaire naald samen met de metalen zuiger door de voorste pakking totdat deze de afstandhouder bereikt (figuur 3C, D, spantang verwijderd voor visualisatie).OPMERKING: Enige weerstand treedt op wanneer de zuiger door de pakking gaat en neemt af wanneer deze de afstandhouder bereikt. Zorg ervoor dat de capillaire naald stevig in de afstandhouder is gestoken om een luchtdichte verbinding te maken (figuur 3D). Zet de naald vast door de spantang van de nanoinjector vast te draaien (schroef deze stevig terug).OPMERKING: Niet te strak aandraaien, omdat dit de naald kan verpletteren. Druk op Leeg om de zuiger in de naald te duwen en de olie uit de naaldpunt te verwijderen. Als de glazen naald beweegt, trekt u de zuiger in, verwijdert u de naald en laadt u deze opnieuw. Als dit ertoe leidt dat er luchtbellen ontstaan, verwijder dan de naald en vul deze opnieuw met minerale olie.OPMERKING: Een goed beveiligde naald mag niet bewegen met de zuiger. Plaats een druppel van het virus (~ 6 μL) of een andere injectieoplossing op een stuk parafilm1 (figuur 3E; Evans blauwe kleurstof wordt gebruikt voor visualisatiedoeleinden).OPMERKING: Het maximale volume van de nanoinjector is ~5 μL. Druk op Fill om een luchtbel te creëren die als scheidingswand tussen de olie en de oplossing dient (figuur 3F).OPMERKING: Dit dient ook als een positioneringsmarker bij het vullen of legen van de naald. Laat de naald zakken, dompel de punt onder in de oplossing en druk op Fill (figuur 3F,G). Let op het vloeistofniveau terwijl de oplossing na de luchtbel wordt geladen. Druk op Leeg om de klomp te verdrijven en herlaad door op Fill te drukken als de luchtbel langwerpig wordt zonder dat de vloeistof de naald binnendringt. Als dit het probleem niet oplost, vervang dan de naald. Wanneer de naald volledig is geladen (figuur 3H), tilt u de naald op in het z-vlak en zuigt u een klein volume lucht aan de punt aan om verdamping van de oplossing aan de punt van de naald en verstopping van de naald te voorkomen. Draai de nanoinjector met de bevestigde naald weg van de operator, naar de achterkant van de bank, om onopzettelijke schade of letsel te voorkomen. Figuur 3: De naald bevestigen aan de nanoinjector en het laden van de oplossing. (A) Uitgangspositie voordat de naald op de nanoinjector wordt gemonteerd: metalen plunjer volledig ingetrokken en spantang bevestigd. (B) Onder de spantang worden alle drie de componenten voor het vasthouden en vastzetten van de naald in de juiste volgorde weergegeven (van links naar rechts): afdichtende O-ring (dun en zwart), afstandhouder (wit), O-ring (zwart) met groot gat (waar de naald doorheen moet). Om een luchtdichte verbinding te garanderen, wordt de glazen naald over de metalen zuiger (C) geschoven en door de opening van de voorste O-ring geduwd totdat deze de afstandhouder (D) bereikt. (E-H) Laden van de oplossing in de naald. (E) Eén druppel oplossing wordt op een stuk parafilm op een plaatdeksel geplaatst. (F) Creëer een luchtbel door op Fill te drukken voordat de oplossing wordt geladen en dompel de naaldpunt onder in de oplossing. (G) Oplossing wordt in de naald geladen. (H) Oplossing wordt in de naald geladen. OPMERKING: De spantang is verwijderd in (B-D) voor visualisatie, maar moet tijdens experimenten bevestigd blijven. De laatste stap van het vastzetten van de naald is het aanspannen van de spantang. Evans blauwe kleurstof wordt gebruikt voor visualisatie in E-H. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 7. Injecties OPMERKING: Alle instrumenten die bij deze procedure worden gebruikt, worden vóór de operatie en tussen elke muis gesteriliseerd. Verdoof het eerste vrouwtje met holtes van ideale grootte (zie rubriek 4). Plaats en fixeer het vrouwtje op de tafel, zoals beschreven in stap 3.1-3.6. Breng ooggel aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en injecteer pijnstiller subcutaan.OPMERKING: Aanbevolen pijnstillers: Buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht) of Flunixin (2,5 mg / kg) of vergelijkbaar in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften. Multimodale perioperatieve analgesie wordt gehandhaafd met geïnjecteerde analgetica en isofluraan. Bereid aseptisch de onderbuik voor door af te vegen met een doek gedrenkt in 0,5 mg / ml chloorhexidine-oplossing (of vergelijkbaar) en droog de huid. Gebruik een chirurgische schaar om een 1,5-2,0 cm verticale midline huidincisie in de onderbuik te maken.OPMERKING: Bereid het chirurgische gebied voor volgens lokaal goedgekeurde desinfectieroutines. Til de huid voorzichtig op en bevrijd de huid van de onderliggende spierlaag, ongeveer 1 cm rond het incisiepunt, om het hechten na de operatie te vergemakkelijken. Maak een 1 cm verticale middellijnincisie in de spierlaag. Til met een tang de ene kant van de huid- en spierlaag op en zoek met het andere paar naar de baarmoederhoorns.OPMERKING: De deciduas zijn gerangschikt als kralen aan een ketting, terwijl de darm één lange, doorlopende buis is (figuur 4A). Trek met een tang voorzichtig beide baarmoederhoorns uit de buik. Houd het weefsel tussen embryo’s; knijp ze niet direct (figuur 4B).OPMERKING: De baarmoeder is bevestigd aan het lichaam bij de baarmoederhals en de twee eierstokken / eileiders zijn bevestigd via ligamenten. Trek/maak de baarmoeder niet los van deze ankerpunten. Tel en noteer het aantal embryo’s aan de linker- en rechterkant. Nummer de embryo’s van de eierstok tot de baarmoederhals of van de baarmoederhals tot de eierstok.OPMERKING: Dit is vooral belangrijk als geïnjecteerde embryo’s in embryonale stadia worden verzameld. Duw met een vochtig wattenstaafje alle embryo’s voorzichtig terug in de buikholte, behalve de eerste drie die moeten worden geïnjecteerd. Plaats een druppel PBS op het elastiek in de petrischaal en houd deze direct boven de embryo’s. Steek een gesloten tang in de incisie van het elastiek en laat de tang los om de elastische incisie te openen, zodat de vloeistof op de embryo’s valt.OPMERKING: Dit zorgt voor rehydratatie van de embryo’s en dat het elastische membraan zich hecht aan de natte huid van het vrouwtje, waardoor lekkage van PBS in de volgende stappen wordt voorkomen. Trek een deel van de baarmoeder, overeenkomend met drie embryo’s, door het elastiek met een tang en plaats voorzichtig de petrischaal op de buik van het vrouwtje. Pas met de tang en een vochtig wattenstaafje de positionering van de baarmoeder en het elastiek aan om ervoor te zorgen dat het elastiek op de huid van het vrouwtje wordt afgedicht om PBS-lekkage te voorkomen. Gebruik de vier kleivoeten om de petrischaal direct boven de buik vast te zetten en vast te maken, waardoor de druk op de vrouw en de gevoeligheid van beeldvorming voor de ademhaling en hartslag van de vrouw worden verminderd. Druk de modelleerkleicilinder rechts van de embryo’s/baarmoeder naar beneden om de baarmoeder te fixeren (figuur 4C).OPMERKING: Deze oriëntatie-instructie gaat ervan uit dat de naald zich links van het vrouwtje bevindt en dat de embryo’s van de linker baarmoederhoorn van het vrouwtje worden blootgesteld. De zijkant van de baarmoeder (linker of rechter baarmoederhoorn) is cruciaal omdat de AC naar de naald kijkt (linkerhoorn; Figuur 4D) of kijkt naar de stabiliserende kleicilinder (rechterhoorn; Figuur 4E). Om embryo’s uit de rechter baarmoederhoorn te injecteren, plaatst u de kleicilinder aan de linkerkant van de embryo’s (figuur 4F) en draait u de verwarmingstafel 180 ° (figuur 4G) om de juiste oriëntatie te bereiken. Als de naald in plaats daarvan kan worden verplaatst, pas deze dan zo nodig aan de relevante opstelling aan. Voeg PBS toe aan de petrischaal totdat de embryo’s en baarmoeder bedekt zijn met PBS. Laat de ultrasone sonde in de PBS zakken en pas de muis / chirurgische tafel aan zodat het eerste embryo is uitgelijnd met de ultrasone sonde om de opname van de injecties te vergemakkelijken.OPMERKING: “Eerste” verwijst naar de nummering van embryo’s van de eierstok tot de baarmoederhals. Scan alle drie de embryo’s en inspecteer de AC’s. Bepaal het injectievolume als volgt:Meet de diameter van de AC met het echoapparaat. Injecteer 69 nL als de AC-diameter ≤0,2 mm is; injecteer 2 x 69 nL (= 138 nL) als de AC-diameter >0,2 mm en ≤0,29 mm is; en injecteer 3 x 69 nL (= 207 nL) als de AC-diameter > 0,29 mm (figuur 4H).OPMERKING: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat tot 207 nL injectievolumes goed worden verdragen bij E7.515. Succesvolle injecties met minimale impact op de overleving worden bereikt wanneer de relatieve volumetoename van de AC niet hoger is dan 90. Variatie in AC-grootte tussen nestgenoten of muizenstammen komt vaak voor en kan verdere optimalisatie vereisen. Stel de injectievolumes in met de injectieregelaar. Stel de injectiesnelheid in op langzaam met een injectiesnelheid van 23 nL/s.OPMERKING: Verschillende apparatuurmodellen kunnen resulteren in verschillende injectiekrachten. Laat de naald in de PBS zakken met behulp van de hoofdwielen op het railsysteem (x- en z-vlakken, figuur 4I) en druk op Leeg op de nanoinjectorcontroller totdat de vloeistof de punt van de naald bereikt.OPMERKING: Als de naald verstopt is, kan het drukken op Leeg de verstopping oplossen en/of de verstopping verdrijven. Til de naald uit de PBS en druk op Injecteren. Controleer of een druppel van het geschatte gewenste volume is ontladen. Laat de naald in de PBS zakken en lijn deze uit met de ultrasone sonde en het embryo door de nanoinjector te bewegen met het y-plane wiel op de micromanipulator (figuur 4J).OPMERKING: De punt van de naald is perfect uitgelijnd wanneer deze als een lichtpuntje op het echografiebeeld verschijnt (figuur 4K, L). De naald kan in alle drie de richtingsvlakken worden bewogen met de micromanipulator. Pas de naaldhoek aan met het injectiehoekwiel om een bijna loodrechte injectiehoek ten opzichte van de baarmoederwand te garanderen. Steek de naald in één beweging in de ac met behulp van het injectiewiel op de micromanipulator (figuur 4J-M). Houd de helderheid van de naaldpunt in de gaten. Als de punt van de naald uit het echografiebeeld verdwijnt, beweegt u de ultrasone sonde naar voren of naar achteren om de naald weer scherp te stellen.OPMERKING: Zodra de naald zich in de AC bevindt, kunnen kleine wijzigingen in de positie en focus van de naald worden aangebracht zonder het embryo te schaden (aanpassingen binnen ~ 0,3 mm). Pas de positie van de naald niet meer aan dan dit. Druk op Injecteren (voor 207 nL, stel het volume in op 69 nL en injecteer drie keer). Wacht na injectie nog eens 5-10 s voordat u de naald in één zachte beweging intrekt. Figuur 4: Optimale grootte en oriëntatie van de vruchtwaterholte voor succesvolle injecties. (A) Baarmoederhoorn met meerdere E7,5-deciduas, in de vorm van een reeks bollen (onder) in vergelijking met dikke darm (boven). (B) Grijp baarmoederweefsel (witte stippellijnen) tussen deciduas. Vermijd het knijpen van de deciduas (witte pijlpunten) direct met een tang, omdat deciduas en zich ontwikkelende embryo’s in dit vroege stadium kwetsbaar zijn en vatbaar voor resorptie bij overmatige externe kracht. (C) Vrouw in rugligging met deciduas blootgesteld in een petrischaal gevuld met PBS en gemonteerd op vier voet modelleerklei. De deciduas worden gestabiliseerd door een extra stuk modelleerklei, in de vorm van een cilinder. (D, E) Oriëntatie van de AC wordt beïnvloed door de zijkant van de baarmoederhoorn die wordt blootgesteld. Als deciduas van de linker baarmoederhoorn worden gebruikt, zal de AC weg van de kleistabilisator kijken en gemakkelijk toegankelijk zijn voor de naald aan de linkerkant (D). Als echter de rechter baarmoederhoorn wordt gebruikt, zal de ectoplacentale kegel in plaats daarvan naar de naald gericht zijn, waardoor het moeilijker wordt om toegang te krijgen tot de AC (E). Daarom wordt bij het injecteren in de rechter baarmoederhoorn de kleistabilisator naar de naaldgerichte kant (F) geplaatst en wordt de hele verwarmingstafel 180 ° (G) gedraaid. (H) Aanbevolen injectievolumes volgens AC-maten. Over het algemeen kunnen holtes met een diameter ≤ 0,2 mm worden geïnjecteerd met een maximum van 69 nL. Diameters > 0,2 mm en ≤ 0,29 mm verdragen volumes tot 2 x 69 nL (138 nL) en holtes > 0,29 mm kunnen worden geïnjecteerd met 3 x 69 nL (207 nL). Schaalstaven = 1 mm. (I, J) Nanoinjector is bevestigd aan het railsysteem en kan in x- en/of z-vlakken worden verplaatst. De hoek van de naald kan worden aangepast met het injectiehoekwiel . (K, L) De punt van de naald (witte pijlpunt) is uitgelijnd met de AC wanneer deze het helderst lijkt in de echografie (L). (M) Echografie afbeelding van het injectieproces, waarbij de naaldpunt zich in de AC bevindt en goed is uitgelijnd (witte pijlpunt). Afkortingen: A = Amnion; AC = vruchtwaterholte; ExC = Exocelomische Holte; EC = Ectoplacentale kegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Verplaats het stadium naar het volgende embryo en herhaal stap 7.22-7.26 voor de andere twee embryo’s als ze geschikte AC-maten hebben. Til de ultrasone sonde en naald uit de PBS met behulp van de micromanipulator. Draai de naald weg van de operator om schade en letsel te voorkomen. Richt met een tang de1e en2e embryo’s terug in de buik van het vrouwtje door ze voorzichtig door het elastiek te duwen. Pak voorzichtig het weefsel naast het3e embryo vast en trek de baarmoeder naar het bovenste uiteinde van de elastische incisie. Trek de4e-6e embryo’s voorzichtig met een tang omhoog en laat het3e embryo opnieuw in de buik komen.OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd zonder de PBS te vervangen of de petrischaal te verwijderen. Herhaal indien nodig totdat alle embryo’s met optimale AC’s zijn geïnjecteerd of de tijdslimiet is bereikt. Duw de embryo’s/baarmoeder voorzichtig terug in de buik van het vrouwtje. Adem de PBS op en verwijder de petrischaal. Als een virus is gebruikt, behandel het dan als besmettelijk afval. Naai de spierlaag samen met Vicryl (USP 6-0, naaldlengte 13 mm, 3/8 Cirkel) in eenvoudige continue of onderbroken hechtingen en sluit de huid met 1-2 clips (zie de Tabel van Materialen). Schakel de isofluraanpomp uit. Verwijder de operatietape en plaats het vrouwtje in buikligging (buik naar beneden) in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 40 °C.OPMERKING: Van het vrouwtje wordt verwacht dat het binnen 10 minuten weer bij bewustzijn komt en mobiel is. Zorg ervoor dat de procedure binnen 30 minuten is voltooid. De genetische achtergrond, leeftijd en het gewicht van de vrouw kunnen de gevoeligheid voor anesthesie beïnvloeden. Controleer de muizen tijdens de operatie op tekenen van langzame ademhaling (langzame ademhaling betekent dat de anesthesie te diep is) of beweging (anesthesie is te licht). Buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg lichaamsgewicht) of Flunixine (2,5 mg/kg) of vergelijkbaar in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften, kan indien nodig 8 uur na de eerste injectie worden verstrekt. Als een ander vrouwtje moet worden geïnjecteerd, bereidt u het chirurgische gebied voor terwijl u het ontwaken van de eerste bewaakt.Veeg de chirurgische hulpmiddelen af met 70% ethanol om achtergebleven bloed of weefsel te verwijderen en steriliseer ze gedurende 10 s in de voorverwarmde glazen kraalsterilisator. Gooi de wattenstaafjes en het gebruikte tissuepapier weg. Veeg de petrischaal en kleistukjes droog met tissuepapier. Herhaal stap 7.1-7.35 totdat alle vrouwtjes zijn geïnjecteerd. Leeg en gooi de naald weg.Als er nog een virus of injectieoplossing in de naald zit, drukt u op Leeg op de nanoinjector en leegt u de inhoud van de naald op tissuepapier. Trek de metalen zuiger volledig in door op Fill te drukken totdat er een dubbele pieptoon van de controller is, wat aangeeft dat de zuiger volledig is ingetrokken. Maak de spantang los en schuif de naald van de metalen zuiger. Gooi de naald weg in de afvalcontainer van de scherpe naald. Maak de BSL-2 bank schoon.Als een virus werd gebruikt, besproei dan het hele chirurgische veld met ontsmettingsmiddel (zie de tabel met materialen). Veeg na 15 minuten het ontsmettingsmiddel af en reinig het hele operatieveld met 70% ethanol. Als er geen virus is gebruikt, reinig dan alle oppervlakken met 70% ethanol. Veeg alle resterende PBS van de ultrasone sonde af met droog, zacht en pluisvrij tissuepapier. Afval weggooien volgens bioveiligheidsrichtlijnen. Schakel het echoapparaat, de verwarmingstafel, de BSL2-bank en de O2-voeding uit.