비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰
Summary
이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.
Abstract
미토콘드리아 레독스 항상성은 신경 생존력과 기능에 중요합니다. 미토콘드리아는 여러 레독스 시스템을 포함하고 있지만, 매우 풍부한 티올-디설파이드 레독스 버퍼 글루타티온은 항산화 방어의 핵심 선수로 간주됩니다. 따라서 미토콘드리아 글루타티온 레독스 전위를 측정하면 미토콘드리아 레독스 상태 및 산화 스트레스에 대한 유용한 정보를 제공한다. 글루타레독신1-roGFP2(Grx1-roGFP2)는 510m에서 단일 방출 피크를 가진 400nm및 490nm에서 2개의 레독스 상태 민감성 난초 피크를 가진 글루타티온 레독스 전위(GFP)-기반 의 유전자 인코딩된 녹색 형광 단백질(GFP)기반 의 비율 지표이다. 이 문서는 1 차해 및 피질 뉴런에서 미토콘드리아 표적 Grx1-roGFP2의 공초점 살아있는 현미경 검사를 수행하는 방법을 설명합니다. 그것은 정상 상태 미토콘드리아 글루타티온 redox 잠재력을 평가하는 방법을 설명 (예를 들어, 질병 상태 또는 장기 치료를 비교) 급성 치료에 레독스 변화를 측정하는 방법 (엑시토 독성 약물 N-메틸-D-아스파르타트 (NMDA를 사용하여) 예를 들어). 또한, 이 기사는 Grx1-roGFP2 및 미토콘드리아 막 전위 지표인 테트라메틸lr호다민, 에틸 에스테르(TMRE)의 공동 이미징을 제시하여 Grx1-roGPF2가 다중 파라메트릭 분석을 위한 추가 지표로 어떻게 멀티플렉스화될 수 있는지를 보여줍니다. 이 프로토콜은 (i) 공초점 레이저 스캐닝 현미경 설정을 최적화하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공하고, (ii) 디아미드및 디티오스레이톨로 센서 교정을 거쳐 자극을 위한 약물을 적용하고, (iii) ImageJ/FIJI로 데이터를 분석한다.
Introduction
몇몇 중요한 미토콘드리아 효소 및 신호 분자는 티올 레독스 규정1의 적용을 받습니다. 더욱이, 미토콘드리아는 반응성 산소 종의 주요 세포 공급원이며 산화 손상에 선택적으로 취약하다2. 따라서, 미토콘드리아 레독스 전위는 생체 에너지, 세포 신호, 미토콘드리아 기능 및 궁극적으로 세포 생존가능성에 직접적인 영향을 미친다3,4. 미토콘드리아 매트릭스는 레독스 항상성을 유지하고 항산화 방어를 탑재하기 위해 티올-디설파이드 레독스 완충글루타티온(GSH)의 고량(1-15 mMM)을 함유하고 있다. GSH는 표적 단백질(S-글루타티온분해)에 공유하여 레독스 상태와 활성을 조절할 수 있으며 산화 단백질을 감소시키는 다양한 해독 효소에 의해 사용됩니다. 따라서 미토콘드리아 글루타티온 레독스 전위는 미토콘드리아 기능 및 병리생리학을 연구할 때 매우 유익한 매개 변수입니다.
roGFP2는 인공 디티올-이설화 쌍을 형성하는 두 개의 표면 노출 시스테인을 첨가하여 레독스에 민감하게 만들어진 GFP의 변종이다7,8. ~510nm에서 단일 방출 피크와 ~400 nm 및 490 nm에서 두 개의 여기 봉우리가 있습니다. 중요한 것은, 두 개의 여기 피크의 상대진폭은 roGFP2(도 1)의 레독스 상태에 따라 달라지며, 이 단백질을 비율 센서로 만듭니다. Grx1-roGFP2 센서에서 인간 글루타레독신-1(Grx1)이 roGFP29,10의 N-종자에 융합되었습니다. roGFP2에 대한 Grx1 효소의 공유 부착은 센서의 두 가지 주요 개선을 제공합니다: GSH/GSSG 글루타티온 레독스 쌍(그림 1)에 대한 센서 반응을 특정하게 만들고, GSSG와 roGFP2 간의 평형을 최소 100,0009배 이상의 비율로 가속화합니다. 따라서 Grx1-roGFP2는 세포 글루타티온 레독스 전위의 특이적이고 역동적인 이미징을 가능하게 합니다.
Grx1-roGFP2 이미징은 넓은 범위의 현미경으로 수행될 수 있으며, 여기에는 넓은 필드 형광 현미경, 회전 디스크 공초점 현미경 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경이 포함됩니다. 1차 뉴런에서 센서의 발현은 lipofection11, DNA/칼슘-인산염 인산염 인계 연수량, 바이러스 매개 유전자 전달, 또는 형질전환 동물의 세포를 세포 공급원으로 사용하는 등 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다(그림 2). AAV1 및 AAV2 캡시드 단백질 13,14의 1:1 비율을 포함하는 의사형 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)가 이 문서에서 실험을 위해 사용되었다. 이 벡터를 사용하면 최대 센서 발현은 일반적으로 감염 후 4-5 일에 도달하고 적어도 2 주 동안 안정적으로 유지됩니다. 우리는 성공적으로 마우스와 쥐에서 1 차해 및 피질 뉴런에서 Grx1-roGFP2를 사용했습니다.
이 문서에서는, 1차 쥐 해마 및 피질 뉴런에서 미토콘드리아 표적 Grx1-roGFP2의 rAAV 매개 발현은 기저 미토콘드리아 글루타티온 레독스 상태와 급성 변투를 평가하는 데 사용된다. (i) 레이저 스캐닝 공초점 현미경 설정을 최적화하는 방법에 대한 자세한 지침과 함께 공초점 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제공되며, (ii) 라이브 이미징 실험을 실행하고 (iii) FIJI와 데이터를 분석한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토콘드리아 레독스 상태의 정량적이고 역동적인 측정은 미토콘드리아 및 세포 생리학에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 반응성 산소 종, “레독스 스트레스” 또는 “산화 스트레스”를 감지하는 여러 불소 화학 프로브를 사용할 수 있습니다. 그러나 후자의 용어는 잘 정의되지 않으며 종종 특이성이 부족합니다9,17,18. 화학 염?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(BA 3679/5-1)에 의해 지원되었다. 2289: BA 3679/4-2). A.K.는 ERASMUS+ 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. 아이리스 뷔즈리-에레트, 리타 로스너, 안드레아 슐릭섭에게 1차 뉴런을 준비해 주셔서 감사합니다. 우리는 pLPCX- 미토 – Grx1-roGFP2를 제공 토비아스 딕 박사에게 감사드립니다. 그림 4 에 나타난 실험은 하이델베르크 대학의 니콘 이미징 센터에서 수행되었다. 도 2 는 BioRender.com 준비하였다.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
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