פרוטוקול זה מתאר שימוש בערכות ביטוי מסחריות של חלבונים נטולי תאים כדי לייצר חלבוני ממברנה הנתמכים בננו-דיסק שיכולים לשמש כאנטיגנים בחיסונים תת-יחידתיים.
חיסונים תת-יחידתיים מציעים יתרונות על פני חיסונים מסורתיים יותר מומתים או מוחלשים שמקורם בתאים שלמים בבטיחות, יציבות וייצור סטנדרטי. כדי להשיג חיסון יעיל מבוסס חלבון תת-יחידה, האנטיגן החלבוני צריך לעתים קרובות לאמץ קונפורמציה דמוית יליד. זה חשוב במיוחד עבור אנטיגנים פני השטח של פתוגן שהם חלבונים הקשורים לקרום. שיטות נטולות תאים שימשו בהצלחה לייצור חלבון ממברנה פונקציונלי מקופל כראוי באמצעות תרגום משותף של חלקיקי ננוליפופרוטאין (NLPs), הידוע בכינויו ננודיסקים.
אסטרטגיה זו יכולה לשמש לייצור חיסונים תת-יחידתיים המורכבים מחלבוני ממברנה בסביבה קשורה לשומנים. עם זאת, ייצור חלבון ללא תאים מוגבל לעתים קרובות בקנה מידה קטן (<1 מ"ל). כמות החלבון המיוצרת בריצות ייצור בקנה מידה קטן מספיקה בדרך כלל למחקרים ביוכימיים וביופיזיקליים. עם זאת, התהליך נטול התאים צריך להיות מורחב, אופטימלי ונבדק בקפידה כדי להשיג מספיק חלבון למחקרי חיסונים במודלים של בעלי חיים. תהליכים אחרים המעורבים בייצור חיסונים, כגון טיהור, תוספת אדג'ובנטית וליופיליזציה, צריכים להיות אופטימליים במקביל. מאמר זה מדווח על פיתוח פרוטוקול מורחב לביטוי, טיהור וניסוח חיסון תת-יחידה חלבוני הקשור לקרום.
תגובות מוגדלות ללא תאים דורשות אופטימיזציה של ריכוזים ויחסים של פלסמיד בעת שימוש במספר וקטורים של ביטוי פלסמיד, בחירת שומנים ותוספת אדג’ובנטית לייצור ברמה גבוהה של חלקיקי ננו-ליפופרוטאין מנוסחים. השיטה מודגמת כאן עם ביטוי של חלבון קרום חיצוני גדול כלמידיאלי (MOMP), אך ניתן ליישם אותה באופן נרחב על אנטיגנים אחרים של חלבון הממברנה. ניתן להעריך את יעילות האנטיגן in vivo באמצעות מחקרי חיסון למדידת ייצור נוגדנים, כפי שהוכח כאן.
ליזטים פרוקריוטים או אאוקריוטים לביטוי ללא תאים של חלבונים זמינים בקלות כמוצרים מסחריים לסינתזה של חלבונים מעניינים (לסקירה מלאה, ראה 1). מערכות ביטוי אלה זמינות בקני מידה שונים ומשתמשות בליזטים מאורגניזמים שונים, כולל E. coli, צמחי טבק ותרביות יונקים. ליזטים נטולי תאים מציעים יתרונות רבים על פני גישות מסורתיות לייצור חלבון רקומביננטי, כולל קלות שימוש וייצור חלבון חזק ומהיר. בעוד גישות אלה משמשות בעיקר לייצור חלבונים מסיסים, קבוצה זו הייתה חלוצה בגישה לשימוש בהם כדי לבטא חלבונים ממברנה.
גישה חדשנית זו מבצעת שינויים קלים במערכות ביטוי חופשיות תאים קיימות על ידי הכללת DNA המקודד שני תוצרי חלבון לביטוי, אפוליפופרוטאין וחלבון הממברנה המעניין. אפוליפופרוטאין מבוטא (נגזרות של ApoA1 או ApoE4) אינטראקציה עם שומנים שנוספו לליזט ללא תאים כדי להרכיב באופן ספונטני (~ 20 ננומטר) NLPs. בתרגום משותף עם חלבון ממברנה מעניין, חלבון ה-NLP והממברנה יוצרים קומפלקס ננו-חלקיקים מסיס שבו חלבון הממברנה מוטמע בתוך דו-שכבת השומנים של NLP. לפיכך, חלבון הממברנה נגיש יותר ליישומים במורד הזרם, מכיוון שהוא כלול בתוך חלקיקים מסיסים ובדידים. גישה זו יכולה לייצר קומפלקסים פונקציונליים של חלבונים אוליגומריים בתוך NLP bilayer2 ויכולה לייצר את מרכיב האנטיגן של חיסון תת-יחידה, אשר לאחר מכן מעורבב עם אדג’ובנטים ליפופיליים ליצירת חיסון ננו-חלקיקים הכולל אנטיגן מקומי ואדג’ובנט המתאים להערכת in vivo .
שיטה נוכחית זו שונה מפרוטוקול3 שפורסם בעבר. שינויים עיקריים מתמקדים בקנה מידה של התגובה ללא תאים וטיהור לאחר מכן של קומפלקס חלבון NLP. שינוי נוסף כולל תוספת של פולימר אמפיפילי המכונה טלודנדרימר, אשר מעורבב תחילה עם השומנים לפני הוספה לתגובה ללא תאים. תרגום משותף של הפלסמידים בנוכחות הטלודנדרימר והשומנים מייצר NLP של טלודנדרימר (tNLP). תוספת הטלודנדרימר מסייעת גם לווסת את הגודל והחד-פיזור של חלקיקי tNLP4 המתקבלים. פרוטוקול זה מותאם במיוחד למחקרי חיסון בקנה מידה גדול לייצור חלבון אנטיגן תת-יחידה הקשור לממברנה, כלמידיאלי MOMP 5,6. השיטה מייצרת MOMP רקומביננטי הקשור ל-tNLP ליצירת קומפלקס MOMP-tNLP מסיס ביותר השומר על אוליגומריזציה של MOMP. ייצור מורחב טיפוסי של 3 מ”ל מניב >1.5 מ”ג של MOMP מטוהר. MOMP-tNLP המיוצר ללא תאים מקובל על תוספת אדג’ובנטית מהירה לבדיקת אימונוגניות in vivo.
כלמידיה היא הזיהום הנפוץ ביותר המועבר במגע מיני המשפיע על גברים ונשים כאחד. למרות שמחקר החיסונים על כלמידיה משתרע על פני עשרות שנים, חיסון בטוח ויעיל שניתן להרחיב אותו לייצור המוני נותר חמקמק13. ה-MOMP הכלמידיאלי נחשב למועמד המוביל כאנטיגן מגן לחיסון; עם זאת, MOMP הוא הידרופובי מאוד ונוטה לקיפול שגוי14,15. מחקר נוסף גילה כי MOMP קיים במצבים אוליגומריים החיוניים לאימונוגניות שלו11. להלן שיטת ביטוי משותף מאומתת ונטולת תאים המייצרת MOMP אוליגומרי שנוצר בתוך ננו-חלקיק tNLP כחיסון, עם תפוקות של כ-1.5 מ”ג MOMP מטוהר לכל 3 מ”ל ליזט. הליך זה שנאסף במלואו יכול להיות מורחב עוד יותר לייצור תעשייתי, להגדיל את הסיכויים שלה כגישה שימושית לייצור חיסונים.
פרסמנו בעבר על שימוש בביטוי חופשי של תאים כדי לייצר חלבוני ממברנה המשובצים בתוך NLPs 3,16, כמו גם ביטוי לתוך דיסקים מיוצבים טלודנדרימר. עם זאת, טכניקה אחרונה זו ייצרה חלקיקי חלבון קרום עם הטרוגניות גדולה יותר ומסיסות נמוכה יותר. 4 בנוסף, האימונוגניות של חלקיקי MOMP-telodendrimer אינה ברורה בהשוואה לחלקיקי MOMP-tNLP6.
הליך זה יכול להיות מותאם כדי להגדיל את הביטוי של חלבוני קרום חיידקי כי הם מועמדים מבטיחים כמו אנטיגנים לשימוש בחיסונים תת יחידה. לא רק שהליך זה מייצר חלבון קרום חיידקי מסיס, אלא שהמבנה הכולל של ננו-חלקיקים ניתן לשינוי נוסף באמצעות מגוון אדג’ובנטים של חיסון ליפופילי, כולל, אך לא רק, CpG מצומד לכולסטרול moiety או FSL-1. ביטוי של אנטיגנים מועמדים אחרים מחיידקים הוא אפשרי, אם כי ייתכן שיהיה צורך לחקור פרמטרים כגון טמפרטורת ביטוי, בחירת שומנים וסוג מערכת הביטוי כדי להשיג תפוקות אופטימליות.
בנוסף, בחירת פלסמיד ויחס הם קריטיים בתהליך זה. שני הפלסמידים המשמשים צריכים להיות בנויים מאותה עמוד שדרה. אם התוספות הן בערך באותו אורך, היחסים יכולים להתבסס על המסה של פלסמיד הוסיף, כמתואר כאן. עם זאת, יחס המבוסס על שומות ייתן תוצאות ניתנות יותר לשחזור, במיוחד בעת שינוי קנה המידה של התגובות. יחסים שפועלים היטב בתגובות בקנה מידה של מסך (< 0.5 מ"ל) עשויים שלא להיות ישימים לתגובות גדולות יותר ולדרוש מיטוב נוסף. חלבונים שאינם ממברנות עדיין ניתנים לביטוי באמצעות ערכות נטולות תאים, אך ייתכן שלא יזדקקו לננו-חלקיק שומנים (ביטוי משותף) כדי לייצר תוצר מסיס. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מתאר אדג'ובנטים עם CpG ו-FSL-1, מערכת זו ניתנת לניסוח עם אדג'ובנטים ליפופיליים אחרים או לערבוב עם אדג'ובנטים מסיסים לפי הצורך.
חיוני להימנע מזיהום בעת הגדרת תגובת הביטוי החופשי של התא, שכן זה יכול להשפיע על התשואות. כל תוספים לתגובה, כולל פלסמידים עצמם, צריך להיות טהור מאוד. בנוסף, החלבונים המבוטאים צריכים להיות במגע רק עם חומרים ותמיסות שאינם נקיים מזיהום אנדוטוקסין. זיהום אנדוטוקסין בניסוחים מועמדים יכול להוביל לתוצאות לא עקביות ומזויפות של בדיקות אימונולוגיות ויכול להזיק בכמויות מספיקות. אמנם לא מתואר כאן, טיהור נוסף בעקבות כרומטוגרפיית זיקה לניקל עשוי להיות נחוץ אם מזהמים רבים נצפים בשלבי ניתוח הבאים כגון באמצעות SDS-PAGE. ניתן להשיג זאת עם SEC, אם כי התנאים עשויים לדרוש אופטימיזציה על בסיס ניסוח על בסיס ניסוח.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק שירות בריאות הציבור R21 AI20925 ו- U19 AI144184 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. עבודה זו בוצעה בחסות משרד האנרגיה של ארה”ב על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור תחת חוזה DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) as powder | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
1.5 mL endotoxin-free centrifuge tubes | Eppendorf | 2600028 | |
1 M Trizma hydrochloride solution | Millipore Sigma | T2194 | |
Acetic acid, glacial, ACS reagent, ≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Buffer Dam for XCell SureLock | Life Technologies | EI0012 | |
C24 Incubator shaker | New Brunswick Scientific | ||
Cell-Free Expression System: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit | BiotechRabbit | BR1400201 | |
cOmplete His-Tag Purification Resin | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Millipore Sigma | 71509 | |
Dialysis tubes D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
Disposable, polypropylene fritted columns 10 mL capacity | Bio-Rad | 7311550EDU | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (PBS) | Millipore Sigma | D8537 | |
Electrophoresis Power Supply | |||
Endosafe PTS cartridge | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
Endosafe-PTS Testing System | Charles River | ||
Gel wash solution: 10% methanol, 7% acetic acid | |||
HCl and NaOH solutions for pH adjustment | |||
HPLC with UV-vis diode array detector | Shimadzu | ||
HyClone HyPure culture-grade water | VWR | 82007-328 | |
iBlot 2 Dry Blotting System | Life Technologies | ||
iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
Image Studio V2.0 software | Li-COR Biiosciences | ||
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
LI-COR Odyssey Fc imager | Li-COR Biiosciences | ||
Lyophilizer | Labconco | ||
Methanol (≥99.9%) | Millipore Sigma | 34860 | |
Microcentrifuge | |||
Microwave oven | |||
NanoDrop One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | NP000202 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Life Technologies | NP0009 | |
Odyssey Blocking Buffer in TBS containing 0.2% Tween 20 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
Orbital Shaker | |||
PBS-T (1x PBS, 0.2% Tween 20, pH 7.4) | |||
PEG5K-CA8 Telodendrimer (custom synthesis product) | |||
pIVEX2.4d vector | Roche Molecular Diagnostics | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
Primary antibody: MAb40 (monoclonal antibody to the variable domain 1 (VD1) of C. muridarum MOMP, de la Maza laboratory)4 | |||
Primary antibody: MAbHIS, Penta-His antibody | Qiagen | 34660 | |
Probe sonicator | |||
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | |
Qubit Protein Assay Kit | Life Technologies | Q33212 | |
Rainin Pipette tips: LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
Rainin Pipette tips: LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
Rainin Pipette tips: LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
Rainin Pipettes | Rainin | ||
Secondary antibody: IRDye 800CW goat (polyclonal) anti-mouse IgG (heavy and light) | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Life Technologies | LC5925 | |
Sodium chloride NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Sodium phosphate monobasic NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
Superdex 200, 5/150 GL column | Cytiva | GE28-9909-45 | |
Synthetic diacylated lipoprotein-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
SYPRO Ruby Protein Gel Stain | Life Technologies | S12001 | |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
UV light source | |||
Vacufuge Bench Top Centrifuge | Eppendorf | ||
Vortexer | |||
VWR 15 mL conicals (89039-666) | VWR | ||
VWR 50 mL conicals (89039-656) | VWR | ||
XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies ) | Life Technologies | EI0001 |