초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템
Summary
이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.
Abstract
~ 뉴런은 뇌의 적절한 기능에 필수적인 회로를 형성하기 위해 정확하게 상호 연결되어 있습니다. Drosophila 후각 시스템은 안테나와 상악 마비의 50 가지 유형의 후각 수용체 뉴런 (ORNs)이 안테나 엽의 50 식별 가능한 사구체에 축색돌기를 투사하고 50 가지 유형의 이차 프로젝션 뉴런 (PN)의 수상 돌기와 시냅스 연결을 형성하기 때문에이 과정을 조사하는 훌륭한 모델을 제공합니다. 이전의 연구는 주로 고정 된 조직을 사용하여 후각 회로에서 정확한 표적화를 조절하는 중요한 분자를 확인하는 데 중점을 두었습니다. 여기에서는 문화에서 후각 회로 조립의 주요 발달 이정표를 되풀이하는 안테나 – 뇌 explant 시스템이 설명됩니다. 외부 큐티클을 해부하고 번데기 뇌를 덮고있는 불투명 한 지방체를 청소함으로써 살아있는 뇌에서 단일 뉴런의 고품질 이미지를 이광자 현미경을 사용하여 수집 할 수 있습니다. 이를 통해 살아있는 조직으로부터 단일 ORN 축삭 표적화의 타임랩스 이미징이 가능합니다. 이 접근법은 이전에 확인 된 중요한 유전자의 중요한 세포 생물학적 맥락과 기능을 밝히고 회로 조립의 동적 과정을 뒷받침하는 메커니즘을 식별하는 데 도움이됩니다.
Introduction
뉴런은 뇌의 적절한 기능에 필수적인 회로를 형성하기 위해 정확하게 상호 연결되어 있습니다. 100 년 이상 동안 신경 과학자들은 신경돌기가 극도의 정밀도로 중간 및 최종 목표를 향해 어떻게 확장되는지 이해하려고 노력해 왔습니다. 결과적으로, 그들은 신경 세포 과정을 개발하기위한 안내 단서를 인코딩하는 중요한 유전자를 확인했습니다1. Drosophila 후각 시스템은 후각 수용체 뉴런 (ORNs, 일차 감각 뉴런)이 고정 관념의 크기, 모양 및 상대적 위치를 가진 50 개의 식별 가능한 사구체에 투사하여 50 가지 유형의 2 차 투영 뉴런 (PN)에서 수상 돌기와 시냅스 연결을 형성하기 때문에이 과정을 조사하는 데 탁월한 모델을제공합니다 (그림 1A ). 따라서, 파리 후각 시스템에서 시냅스(사구체) 분해능에서 돌연변이 표현형을 확인하는 것은 비교적 쉽다. 이로 인해 후각 회로 어셈블리를 조절하는 중요한 유전자가 발견되었습니다3.
플라이 후각 회로의 조립은 시간적, 공간적으로 조정 된 발달 과정3에 의존합니다. ORN과 PN은 뚜렷한 세포 운명을 획득하여 배선 특이성에 대한 프로그램을 설정합니다. 다음으로, PN 수상 돌기는 안테나 로브를 미리 패턴화합니다(그림 1B). ORN의 축삭은 동측성 안테나 엽을 우회하고 뇌의 중간 선을 교차하여 대측 안테나 엽에 도달합니다. 그 후, ORN 축삭은 ipsi- 및 대측성 안테나 엽 모두를 침범하고 특정 사구체에서 파트너 PN의 수상 돌기와 함께 시냅스를 형성합니다. 후각 회로 조립을 위한 이 거친 모델은 개발 중 중간 시점으로부터 고정된 샘플의 특성화를 기반으로 제안되었다. 열악한 시간적 분해능과 고정 조직으로부터 발달 전반에 걸쳐 동일한 뉴런 과정을 따를 수 없다는 것은 회로 조립 공정에 대한 기계론적 이해를 제한한다.
안테나 로브가 번데기 케이스 내부의 불투명 한 지방체로 둘러싸여있을 때 번데기 단계의 전반부에서 배선 과정이 발생하기 때문에 생체 내에서 ORN 및 PN 프로세스를 라이브하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 따라서 손상되지 않은 번데기에서 발달하는 후각 회로를 직접 이미지화하는 것은 불가능합니다. 생체외에서 배양된 해부된 조직은 조직 불투명도를 회피할 수 있고, 신경 발달4,5,6을 연구하는데 성공적으로 이용되었다. 번데기 뇌에서 뉴런 배선을 연구하기 위해 유사한 생체외 외래 배양 전략을 사용하는 과제는 배양 조건에서 정확한 뉴런 표적화를 되풀이하는지 여부입니다. 플라이 안구-뇌 복합체(7)에 대한 이전에 보고된 생체외 배양 조건에 기초하여, 번데기 전체 뇌, 안테나, 및 연결 안테나 신경을 온전하게 포함하는 외래 식물이 최근에 개발되어 후각 회로의 정확한 표적화를 유지하고 매 20분마다8의 주파수에서 최대 24시간 동안 이광자 현미경 기반 라이브 이미징을 실시할 수 있다. . 여기에서, explant 배양 및 이미징의 상세한 프로토콜이 설명된다. explant 시스템은 후각 회로 및 중앙 뇌의 잠재적으로 다른 회로의 어셈블리를 연구하는 강력한 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초파리 안테나-뇌 explant는 후각 회로의 정상적인 표적을 유지합니다. 우리는 발달이 생체 내에서보다 2 배 느린 생체 외 발달을 알아 차렸다. explant 시스템은 여섯 가지 유형의 ORN을 호스팅하는 상악 마비를 유지하지 않습니다. 정상적인 발달이 생체 외에서 되풀이되도록하기 위해, 안테나 신경의 스트레칭은 explant 해부 중에 피할 필요가 있습니다. 생체외 배양 동…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 N. Özel과 R. Hiesinger에게 explant 문화에 대한 조언에 감사드립니다. M. 이광자 현미경의 기술적 도움을 위한 바그너; D.J. 형질전환 파리를 생성하기 위한 루긴불; D. 피지 소프트웨어 분석의 제안에 대한 프리드만; Y. 비행 작업에 대한 지원을위한 Ge; C. McLaughlin과 K.K.L. Wong 은 원고에 대한 의견을 제시합니다. L.L.은 하워드 휴즈 의학 연구소 연구원입니다. 이 연구는 국립 보건원 보조금 1K99DC01883001 (T.L.) 및 R01-DC005982 (L.L.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
References
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