Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila

Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de goede werking van de hersenen. Al meer dan 100 jaar proberen neurowetenschappers met extreme precisie te begrijpen hoe neurieten zich uitstrekken naar hun tussen- en einddoelen. Als gevolg hiervan hebben ze belangrijke genen geïdentificeerd die coderen voor aanwijzingen voor het ontwikkelen van neuronale processen¹. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien olfactorische receptorneuronen (ORN’s, de primaire sensorische neuronen) projecteren op 50 identificeerbare glomeruli met stereotiepe grootte, vorm en relatieve positie, waar ze synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR’s), die elk dendrieten naar een van de 50 glomeruli² sturen (figuur 1A ). Daarom is het relatief eenvoudig om gemuteerde fenotypen te identificeren bij synaptische (glomerulaire) resolutie in het reuksysteem van de vlieg. Dit leidde tot ontdekkingen van belangrijke genen die de assemblage van olfactorische circuits^{reguleren 3}.

De assemblage van het reukcircuit van de vlieg is afhankelijk van temporeel en ruimtelijk gecoördineerde ontwikkelingsprocessen³. ORN’s en PN’s krijgen verschillende celbestemmingen, die het programma opzetten voor hun bedradingsspecifieke kenmerken. Vervolgens prepatriëren PN-dendrieten de antennekwab (figuur 1B). De axonen van ORN’s omcirkelen vervolgens de ipsilaterale antennekwab en kruisen de middellijn van de hersenen om de contralaterale antennekwab te bereiken. Vervolgens dringen ORN-axonen zowel ipsi- als contralaterale antennelobben binnen en vormen synapsen met dendrieten van hun partner-PR’s in specifieke glomeruli. Dit grove model voor olfactorische circuitassemblage werd voorgesteld op basis van de karakterisering van vaste monsters uit tussenliggende tijdspunten tijdens de ontwikkeling. De slechte temporele resolutie en het onvermogen om dezelfde neuronale processen te volgen tijdens de ontwikkeling van vast weefsel beperken het mechanistische begrip van het circuitassemblageproces.

Het is technisch een uitdaging om ORN- en PN-processen in vivo te leven, omdat het bedradingsproces plaatsvindt in de eerste helft van het popstadium wanneer de antennekwab wordt omringd door ondoorzichtig vetlichaam in de pop. Het is daarom onmogelijk om het zich ontwikkelende reukcircuit van intacte poppen direct in beeld te brengen. Ontleedde weefsels die ex vivo zijn gekweekt, kunnen weefselopaciteit omzeilen en zijn met succes gebruikt om de neurale ontwikkeling te^{bestuderen 4,5,6}. De uitdaging van het gebruik van een vergelijkbare ex vivo explantcultuurstrategie om neuronale bedrading in het popbrein te bestuderen, is of het de precieze neurontargeting in een cultuurconditie samenvat. Op basis van een eerder gerapporteerde ex vivo kweekconditie voor het fly eye-brain complex⁷, is onlangs een explant ontwikkeld die het hele popbrein, antennes en de verbindende antennezenuwen intact bevat, die nauwkeurige targeting van het reukcircuit behoudt en kan worden onderworpen aan op twee fotonenmicroscopie gebaseerde live beeldvorming tot 24 uur met de frequentie van elke 20 min⁸ . Hier wordt een gedetailleerd protocol van de explantcultuur en beeldvorming beschreven. Het explantingsysteem biedt een krachtige methode om de assemblage van olfactorische circuits en mogelijk andere circuits in de centrale hersenen te bestuderen.