Summary

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Published: December 07, 2021
doi:

Summary

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Abstract

Staaffotoreceptoren zijn sterk gepolariseerde sensorische neuronen met verschillende compartimenten. Muizenstaafjes zijn lang (~ 80 μm) en dun (~ 2 μm) en zijn zijdelings verpakt in de buitenste laag van het netvlies, de fotoreceptorlaag, wat resulteert in uitlijning van analoge subcellulaire compartimenten. Traditioneel is tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde netvlies gebruikt om de beweging en lokalisatie van eiwitten binnen verschillende staafcompartimenten te bestuderen. De hoge kromming van het staaf-dominante muizennet maakt tangentiële sectie echter een uitdaging. Gemotiveerd door de studie van eiwittransport tussen compartimenten, ontwikkelden we twee peelingmethoden die het staafbuitensegment (ROS) en andere subcellulaire compartimenten voor western blots betrouwbaar isoleren. Onze relatief snelle en eenvoudige technieken leveren verrijkte en subcellulair-specifieke fracties om de verdeling en herverdeling van belangrijke fotoreceptoreiwitten in normale staafjes kwantitatief te meten. Bovendien kunnen deze isolatietechnieken ook gemakkelijk worden aangepast om de eiwitsamenstelling van andere cellulaire lagen in zowel gezond als degenererend netvlies te isoleren en kwantitatief te onderzoeken.

Introduction

Staaffotoreceptorcellen, strak verpakt in de buitenste laag van het neurale netvlies, zijn een integraal onderdeel van het zicht op zwak licht. Om te functioneren als getrouwe fotonentellers, gebruiken staafjes een op G-eiwit gebaseerde signaalroute, fototransductie genaamd, om snelle, versterkte en reproduceerbare reacties op het vastleggen van enkele fotonen te genereren. Deze reactie op licht veroorzaakt uiteindelijk een verandering in de stroom bij het plasmamembraan en wordt vervolgens gesignaleerd aan de rest van het visuele systeem1. Zoals hun naam al aangeeft, heeft elke staafcel een verschillende staafachtige vorm en vertoont een sterk gepolariseerde cellulaire morfologie, bestaande uit een buitenste segment (OS), binnensegment (IS), cellichaam (CB) en synaptische terminal (ST). Elk subcellulair compartiment heeft specifieke eiwitmachines (membraangebonden en oplosbaar), biomoleculaire kenmerken en eiwitcomplexen die een cruciale rol spelen, zoals visuele fototransductie, algemene huishouding en eiwitsynthese, en synaptische transmissie2,3.

Meer dan 30 jaar geleden werd de lichtafhankelijke wederzijdse beweging van subcellulaire eiwitten, met name transducine (weg van het OS) en arrestine (naar het OS), voor het eerst waargenomen4,5,6,7. Al vroeg werd dit waargenomen fenomeen met scepsis ontvangen, deels vanwege de kwetsbaarheid van immunohistochemie voor epitoopmaskering8. In de vroege jaren 2000 werd stimulusafhankelijke eiwittranslocatie bevestigd met behulp van een rigoureuze en zware fysieke sectietechniek9. Seriële tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde knaagdier retinae gevolgd door immunoblotting onthulde dat transducine9,10, arrestin11,12 en recoveryin13 allemaal subcellulaire herverdeling ondergaan als reactie op licht. Er wordt aangenomen dat lichtgestuurde translocatie van deze belangrijke signaaleiwitten niet alleen de gevoeligheid van de fototransductiecascade9,14,15 reguleert, maar ook neuroprotectief kan zijn tegen lichtschade16,17,18. Omdat lichtgedreven eiwittransport in staven zeer belangrijk lijkt te zijn voor de biologie en fysiologie van staafcellen, zijn technieken die de isolatie van verschillende subcellulaire compartimenten mogelijk maken om de eiwitverdeling te bepalen waardevolle onderzoeksinstrumenten.

Momenteel zijn er een paar methoden gericht op het isoleren van de staafsubcellulaire compartimenten. Deze methoden kunnen echter lang en moeilijk te reproduceren zijn, of vereisen een aanzienlijke hoeveelheid retinaal isolaat. Staaf buitensegment (ROS) preparaten via dichtheidsgradiënt centrifugatie19 wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om de ROS te scheiden van retinaal homogenaat. Deze methode wordt veel gebruikt voor western blot, maar de procedure is zeer tijdrovend en vereist een minimum van 8-12 murine retinae20. Aan de andere kant is seriële tangentiële sectie van bevroren murine en rat retinae met succes geïmplementeerd bij het isoleren van het OS, IS, CB en ST9,11,13. Deze methode is echter technisch uitdagend vanwege de noodzaak om het kleine en sterk gebogen muriene netvlies volledig af te vlakken om de retinale lagen uit te lijnen voorafgaand aan tangentiële sectie. Aangezien er een overvloed aan muismodellen en transgene muizen zijn die ziekten van het visuele systeem samenvatten, is de creatie van een techniek die betrouwbaar, snel en gemakkelijk individuele staafcompartimenten scheidt veelbelovend bij het onthullen van de fysiologische processen die zich voordoen in elk gespecialiseerd compartiment en de mechanismen die ten grondslag liggen aan visuele processen in gezondheid en ziekte.

Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, beschrijven we twee peelingmethoden die staafsubcellulaire compartimenten gemakkelijker isoleren dan de huidige protocollen. De eerste peelingmethode, aangepast van een techniek om fluorescerend gelabelde bipolaire cellen bloot te leggen voor patchklemregistratie21, maakt gebruik van cellulosefilterpapier om de ROS sequentieel te verwijderen van een levend, geïsoleerd murine netvlies (figuur 1). De tweede methode, aangepast van een procedure die de drie primaire retinale cellagen isoleert van een chick22 en frog23 retina, maakt gebruik van plakband om het ROS- en staafbinnensegment (RIS) van een gelyofiliseerd netvlies te verwijderen (figuur 2). Beide procedures kunnen in 1 uur worden voltooid en zijn aanzienlijk gebruiksvriendelijk. We bieden validatie van de effectiviteit van deze twee scheidingsprotocollen voor western blot door gebruik te maken van donker-aangepast en aan licht blootgesteld netvlies van C57BL / 6J-muizen om lichtgeïnduceerde translocatie van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) aan te tonen. Bovendien leveren we met behulp van de tape peeling-methode aanvullend bewijs dat onze techniek kan worden gebruikt om inconsistenties tussen eiwitlokalisatiegegevens verkregen door immunocytochemie (ICC) en western blots te onderzoeken en aan te pakken. Concreet toonde onze techniek aan dat: 1) het eiwitkinase C-alfa (PKCα) isovorm niet alleen aanwezig is in bipolaire cellen, maar ook in murine ROS en RIS, zij het in lage concentraties24,25, en 2) rhodopsinekinase (GRK1) voornamelijk aanwezig is in het geïsoleerde OS-monster. Deze gegevens tonen de effectiviteit aan van onze twee peelingtechnieken voor het scheiden en kwantificeren van specifieke staaf- en retinale eiwitten.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale institutionele richtlijnen van de commissie voor dierverzorging van de University of Southern California (USC). 1. Live cell retinal peeling methode Bereiding van Ames’ buffers, schilpapier en dissectieschotel Knip met een irisschaar met stompe punt (of een gelijkwaardig schaartype) het cellulosefilterpapier (grade 413) in rechthoeken van ongeveer 5 mm x 2,5 mm. Bewaar de stekken voor toekomstig gebruik.</…

Representative Results

De huidige strategieën zijn ontwikkeld om relatief snelle en eenvoudige methoden te bieden om eiwitten te isoleren en te analyseren tussen specifieke staafsubcellulaire compartimenten voor western blot-analyse. We pasten twee sequentiële peelingtechnieken toe (figuur 1 en figuur 2), gevolgd door immunoblotting om aan te tonen dat deze methoden betrouwbaar kunnen worden gebruikt om de bekende verdeling van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) bij zowel …

Discussion

Veel retinale ziekten beïnvloeden staaffotoreceptorcellen, wat leidt tot staafdood en uiteindelijk volledig verlies van het gezichtsvermogen37. Een aanzienlijk deel van de genetische en mechanistische oorsprong van menselijke retinale degeneratie is in de loop der jaren met succes samengevat in tal van muismodellen. In die context zou het vermogen om gemakkelijk en selectief individuele staafsubcellulaire compartimenten van het kleine muizennet te scheiden ons begrip van de gelokaliseerde biochem…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY12155, EY027193 en EY027387 aan JC. We zijn Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) en Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) dankbaar voor het proeflezen van het manuscript. We willen ook Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, VS) en Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, VS) bedanken voor het leveren van de benodigde apparatuur om de door de auteur verstrekte beelden te verzamelen. Materiaal van: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, published [2017], [Springer Nature].

Materials

100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neurosciences. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Play Video

Citer Cet Article
Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

View Video