यह प्रोटोकॉल मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति, अनुक्रमण और डी नोवो हाइब्रिड जीनोम असेंबली के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण का विवरण देता है। यह मूत्र उपनिवेशीकरण, रोगजनन और रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रसार में योगदान देने वाले गुणसूत्र और एक्सट्राक्रोमोमल आनुवंशिक तत्वों दोनों का अध्ययन करने में उपयोगी पूर्ण, परिपत्र जीनोम दृश्यों की पीढ़ी के लिए एक प्रजनन योग्य प्रक्रिया प्रदान करता है।
पूर्ण जीनोम दृश्य आनुवंशिक विविधता और मूत्र रोगाणुओं के अद्वितीय उपनिवेशीकरण कारकों की समझ के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान करते हैं। इन आंकड़ों में प्लाज्मिड और एक्सट्राक्रोमोमोमल फेज जैसे मोबाइल जेनेटिक तत्व शामिल हो सकते हैं, जो एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध के प्रसार में योगदान देते हैं और मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई) के उपचार को और जटिल बनाते हैं। जीनोम संरचना का ठीक समाधान प्रदान करने के अलावा, पूर्ण, बंद जीनोम विस्तृत तुलनात्मक जीनोमिक्स और विकासवादी विश्लेषणों के लिए अनुमति देते हैं। उपलब्ध अनुक्रमण प्रौद्योगिकी की सीमाओं के कारण पूर्ण जीनोम डी नोवो की पीढ़ी लंबे समय से एक चुनौतीपूर्ण कार्य रही है। युग्मित-अंत अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) उच्च गुणवत्ता कम पढ़ता है अक्सर सटीक लेकिन खंडित जीनोम विधानसभाओं में जिसके परिणामस्वरूप पैदा करता है । इसके विपरीत, नैनोपोर अनुक्रमण कम गुणवत्ता के लंबे समय तक पढ़ता है सामान्य रूप से त्रुटि प्रवण पूर्ण विधानसभाओं के लिए अग्रणी प्रदान करता है। ऐसी त्रुटियां जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययनों में बाधा डाल सकती हैं या भ्रामक संस्करण विश्लेषण परिणाम प्रदान कर सकती हैं। इसलिए, संकर दोनों छोटे और लंबे पढ़ता है संयोजन दृष्टिकोण अत्यधिक सटीक बंद जीवाणु जीनोम को प्राप्त करने के लिए विश्वसनीय तरीकों के रूप में उभरा है । यहां रिपोर्ट विविध मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति के लिए एक व्यापक विधि है, 16S rRNA जीन अनुक्रमण द्वारा प्रजातियों की पहचान, जीनोमिक डीएनए (gDNA) का निष्कर्षण, और कम और लंबे समय से देखा जाता है की पीढ़ी क्रमशः NGS और नैनोपोर प्लेटफार्मों द्वारा पढ़ता है । इसके अतिरिक्त, यह विधि एनोटेटेड पूर्ण जीनोम दृश्यों की पीढ़ी के लिए गुणवत्ता नियंत्रण, असेंबली और जीन भविष्यवाणी एल्गोरिदम की जैव सूचनाबद्ध पाइपलाइन का वर्णन करती है। बायोइंफॉर्मेटिक टूल्स का संयोजन हाइब्रिड जीनोम असेंबली और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले पढ़े गए डेटा के चयन में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित हाइब्रिड डी नोवो जीनोम असेंबली के लिए सुव्यवस्थित दृष्टिकोण को किसी भी कृषि योग्य बैक्टीरिया में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
मूत्र माइक्रोबायोम अनुसंधान का एक उभरता हुआ क्षेत्र है जिसने दशकों लंबी गलतफहमी को चकनाचूर कर दिया है कि मूत्र पथ स्वस्थ व्यक्तियों में बाँझ है। मूत्र माइक्रोबायोटा के सदस्य मूत्र वातावरण को संतुलित करने और मूत्र पथ संक्रमण (यूटीआई)1,2को रोकने के लिए काम करसकतेहैं । यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया मूत्र पथ पर आक्रमण करते हैं और निवासी माइक्रोबायोटा को विस्थापित करने, यूरोथेलियम को उपनिवेश बनाने, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने और पर्यावरणीय दबावों का प्रतिकार करने के लिए विविध उग्रता तंत्रको नियोजितकरते हैं3,4 । मूत्र एक अपेक्षाकृत पोषक तत्व-सीमित माध्यम है जो उच्च ऑस्मोलेरिटी, सीमित नाइट्रोजन और कार्बोहाइड्रेट की उपलब्धता, कम ऑक्सीजन, और कम पीएच5,6,7की विशेषता है। मूत्र को रोगाणुरोधी भी माना जाता है, जो निरोधात्मक यूरिया और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स जैसे मानव कैथेलिडिनएलएल-37 8की उच्च सांद्रता से बना होता है। मूत्र पथ को उपनिवेश बनाने के लिए निवासी बैक्टीरिया और यूरोपैथोजेन दोनों द्वारा नियोजित तंत्र की जांच करना मूत्र पथ के स्वास्थ्य को और अधिक समझने और यूटीआई उपचार के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, फ्रंट-लाइन एंटीमाइक्रोबियल उपचारों की विफलता के रूप में अधिक आम हो जाता है, मूत्र बैक्टीरिया9,10की आबादी के भीतर एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध निर्धारकों को ले जाने वाले मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के प्रसार की निगरानी करना तेजी से महत्वपूर्ण है।
मूत्र बैक्टीरिया के जीनोटाइप और फेनोटाइप की जांच करने के लिए, उनकी सफल संस्कृति और बाद में पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) जरूरी है। मूत्र के नमूनों में व्यवहार्य रोगाणुओं का पता लगाने और उनकी पहचान करने के लिए संस्कृति पर निर्भर तरीके आवश्यक हैं11। मानक नैदानिक मूत्र संस्कृति में 5% भेड़ रक्त आगार (बीएपी) और मैककोंकी आगर पर मूत्र चढ़ाना और 24 एच12के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर एयरोब्यूकल रूप से इनक्यूबेटिंग करना शामिल है। हालांकि, ≥105 सीएलयू/एमएल13की पहचान सीमा के साथ, मूत्र माइक्रोबायोटा के कई सदस्यों को इस विधि द्वारा सूचित नहीं किया जाता है। उन्नत मात्रात्मक मूत्र संस्कृति (इक्वेसी)11 जैसी बेहतर संस्कृति तकनीकों में विभिन्न मूत्र की मात्रा, इनक्यूबेशन बार, संस्कृति मीडिया और वायुमंडलीय स्थितियों के विभिन्न संयोजनों को नियोजित किया जाता है ताकि आमतौर पर मानक मूत्र संस्कृति द्वारा छूटे रोगाणुओं की पहचान की जा सके। इस प्रोटोकॉल में वर्णित EQUC का एक संशोधित संस्करण है, जिसे यहां संशोधित संवर्धित मूत्र संस्कृति प्रोटोकॉल कहा जाता है, जो चयनात्मक मीडिया और इष्टतम वायुमंडलीय स्थितियों का उपयोग करके विविध मूत्र बैक्टीरिया और यूरोपैथोजेन की खेती को सक्षम बनाता है लेकिन स्वाभाविक मात्रात्मक नहीं है। मूत्र बैक्टीरिया का सफल अलगाव डाउनस्ट्रीम डब्ल्यूजीएस और जीनोम असेंबली के लिए जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) को निकालने में सक्षम बनाता है।
जीनोम असेंबली, विशेष रूप से पूर्ण असेंबली, आनुवंशिक कारकों की खोज को सक्षम करती हैं जो उपनिवेशीकरण, आला रखरखाव और दोनों निवासी माइक्रोबायोटा और यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया के बीच उग्रता में योगदान दे सकते हैं। ड्राफ्ट जीनोम असेंबली में विभिन्न प्रकार के समीपस्थ दृश्य (स्टिग्स) होते हैं जिनमें अनुक्रमण त्रुटियां हो सकती हैं और अभिविन्यास जानकारी की कमी हो सकती है। एक पूर्ण जीनोम असेंबली में, प्रत्येक आधार जोड़ी के अभिविन्यास और सटीकता दोनों को14सत्यापित किया गया है। इसके अलावा, पूर्ण जीनोम दृश्यों को प्राप्त करना जीनोम संरचना, आनुवंशिक विविधता और मोबाइल आनुवंशिक तत्वों15में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। केवल छोटे पढ़ते हैं कि महत्वपूर्ण जीनों की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पहचान हो सकती है लेकिन उनके जीनोमिक संदर्भकोइंगित नहीं कर सकते हैं । ऑक्सफोर्ड नैनोपोर और PacBio जैसी लंबे समय से पढ़ी जाने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को सक्षम करने के साथ, बैक्टीरियल जीनोम की बंद डी नोवो विधानसभाओं को उत्पन्न करने के लिए अब मल्टीप्लेक्स पीसीआर17,18द्वारा डी नोवो विधानसभाओं को मैनुअल बंद करने जैसे ज़ोरदार तरीकों की आवश्यकता नहीं है। अगली पीढ़ी के छोटे-पढ़ने वाले अनुक्रमण और नैनोपोर लंबे समय से पढ़ी जाने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का संयोजन अपेक्षाकृत कम लागत19पर सटीक, पूर्ण और बंद बैक्टीरियल जीनोम असेंबली की फेसियल पीढ़ी की अनुमति देता है। लघु पढ़ें अनुक्रमण सटीक अभी तक खंडित जीनोम विधानसभाओं आम तौर पर 40-100 contigs के एक औसत से मिलकर पैदा करता है, जबकि नैनोपोर अनुक्रमण लंबाई में लगभग 5-100 किलोब के लंबे समय से पढ़ता है कि कम सटीक हैं, लेकिन मचान के रूप में काम कर सकते है contigs में शामिल होने और जीनोमिक सिंटेनी को हल । हाइब्रिड दोनों कम पढ़ा और लंबे समय से पढ़ने वाली प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने वाले दृष्टिकोण सटीक और पूर्ण जीवाणु जीनोम19का उत्पादन कर सकते हैं ।
यहां वर्णित अलगाव और मानव मूत्र, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, अनुक्रमण, और एक संकर विधानसभा दृष्टिकोण का उपयोग कर पूर्ण जीनोम विधानसभा से बैक्टीरिया की पहचान के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है । यह प्रोटोकॉल एक बंद बैक्टीरियल गुणसूत्र और प्लाज्मिड जैसे एक्सार्मोमोमल तत्वों की सटीक असेंबली के लिए कम-पढ़ने और लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न रीड को ठीक से संशोधित करने के लिए आवश्यक कदमों पर विशेष जोर देता है।
यहां वर्णित व्यापक हाइब्रिड जीनोम असेंबली प्रोटोकॉल विविध मूत्र माइक्रोबायोटा और यूरोपाथोमोजेन की सफल खेती और उनके जीनोम की पूरी असेंबली के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करता है। जीवाणु जीनोम के सफल WGS विविध और कई बार दुराग्रही रोगाणुओं के अलगाव के साथ शुरू होता है ताकि उनके जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए । आज तक, मौजूदा मूत्र संस्कृति प्रोटोकॉल में कई मूत्र प्रजातियों का पता लगाने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता की कमी होती है या इसमें लंबे और व्यापक दृष्टिकोण शामिल होते हैं जिन्हें विस्तारित समय और संसाधनों की आवश्यकता होती है11। संशोधित संवर्धित मूत्र संस्कृति दृष्टिकोण वर्णित 17 आम मूत्र जेनेरा से संबंधित बैक्टीरिया के सफल अलगाव के लिए एक सरलीकृत अभी तक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसमें संभावित रोगजनक या लाभकारी अनुकूल प्रजातियां शामिल हैं, और संकाय और अनिवार्य एरोबिक या अवायरोबिक बैक्टीरिया दोनों शामिल हैं। यह बदले में सटीक अनुक्रमण और बैक्टीरियल जीनोम की असेंबली के लिए और महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक प्रयोगों के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री प्रदान करता है, जो मूत्र स्वास्थ्य और रोग की समझ में योगदान देता है। इसके अलावा, यह संशोधित संस्कृति दृष्टिकोण मूत्र नमूनों में पाए जाने वाले व्यवहार्य सूक्ष्मजीवों के अधिक परिभाषित नैदानिक निदान के लिए प्रदान करता है और भविष्य के जीनोमिक अध्ययनों के लिए उनके बायोबैंकिंग के लिए अनुमति देता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल सीमाओं के बिना नहीं है। जीव के साथ-साथ एक हाइपोक्सिया कक्ष या नियंत्रित इनक्यूबेटर जैसे संसाधनों के उपयोग के आधार पर लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकते हैं। अवायवीय GasPaks का उपयोग एक वैकल्पिक समाधान प्रदान करता है, लेकिन ये महंगा कर रहे है और हमेशा एक निरंतर और नियंत्रित वातावरण का उत्पादन नहीं करते । अंत में, संस्कृति पूर्वाग्रह के साथ-साथ नमूना विविधता विशेष जीवों और यूरोपाथोजनों को दुराग्रही बैक्टीरिया से मात देने की अनुमति दे सकती है। इन सीमाओं के बावजूद, इस दृष्टिकोण से विविध मूत्र बैक्टीरिया की संस्कृति संभव हो जाती है।
जीनोमिक अनुक्रमण ने अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की उन्नति के साथ लोकप्रियता हासिल की है जिससे अनुक्रमण डेटा14,15की उपज और सटीकता दोनों में काफी वृद्धि हुई है । डेटा प्रोसेसिंग और डी नोवो असेंबली के लिए एल्गोरिदम के विकास के साथ मिलकर, पूर्ण जीनोम दृश्य नौसिखिए और विशेषज्ञ वैज्ञानिकों की उंगलियों पर हैं, जो समान रूप से15,45हैं। पूर्ण जीनोम द्वारा प्रदान किए गए समग्र जीनोम संगठन का ज्ञान महत्वपूर्ण विकासवादी और जैविक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जिसमें जीन दोहराव, जीन हानि, और क्षैतिज जीन हस्तांतरण14शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, रोगाणुरोधी प्रतिरोध और उग्रता के लिए महत्वपूर्ण जीन अक्सर मोबाइल तत्वों पर स्थानीयकृत होते हैं, जिन्हें आमतौर पर15, 16के मसौदे में जीनोम असेंबली में हल नहीं कियाजाताहै।
यहां प्रोटोकॉल पूर्ण जीनोम असेंबली उत्पन्न करने के लिए कम-पढ़ने वाले और लंबे समय तक पढ़े जाने वाले प्लेटफार्मों से अनुक्रमण डेटा के संयोजन के लिए एक संकर दृष्टिकोण का पालन करता है। मूत्र जीवाणु जीनोम पर ध्यान केंद्रित करते हुए, इस प्रक्रिया को विभिन्न अलगाव स्रोतों से विविध बैक्टीरिया के अनुकूल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण कदम पर्याप्त बाँझ तकनीक का पालन और शुद्ध मूत्र बैक्टीरिया के अलगाव के लिए उपयुक्त मीडिया और संस्कृति की स्थिति का उपयोग शामिल हैं । इसके अलावा, बरकरार, उच्च उपज gDNA की निकासी दूषित से मुक्त डेटा अनुक्रमण पैदा करने के लिए आवश्यक है कि विधानसभा की सफलता में बाधा हो सकती है । बाद में पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल गुणवत्ता की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं पर्याप्त लंबाई और गहराई के पढ़ता है। इसलिए, विशेष रूप से लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी के दौरान देखभाल के साथ gDNA को संभालना बिल्कुल महत्वपूर्ण है, क्योंकि इस तकनीक का सबसे बड़ा लाभ लंबे समय तक कोई सैद्धांतिक ऊपरी लंबाई सीमा के साथ पढ़ता है। इसके अलावा उल्लिखित अनुक्रमण के उचित गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के लिए अनुभाग हैं जो शोर डेटा को समाप्त करते हैं और असेंबली परिणाम में सुधार करते हैं।
सफल डीएनए अलगाव, पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के बावजूद, कुछ प्रजातियों की जीनोमिक वास्तुकला की प्रकृति अभी भी बंद जीनोम असेंबली45,46की पीढ़ी के लिए एक बाधा प्रदान कर सकती है। दोहराव दृश्यों अक्सर विधानसभा गणना जटिल और लंबे समय तक पढ़ा डेटा के बावजूद, इन क्षेत्रों को कम विश्वास के साथ हल किया जा सकता है, या बिल्कुल नहीं । लंबे समय से पढ़ता है इस प्रकार जीनोम में सबसे बड़ा दोहराने क्षेत्र से अधिक समय तक औसत पर होना चाहिए या कवरेज उच्च (>100x)19होना चाहिए । कुछ जीनोम अधूरे रह सकते हैं और पूरा करने के लिए मैनुअल दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। फिर भी, हाइब्रिड इकट्ठे अधूरे जीनोम आमतौर पर कम पढ़े गए ड्राफ्ट जीनोम की तुलना में कम कॉन्टिग्स से बने होते हैं। असेंबली एल्गोरिदम के डिफ़ॉल्ट मापदंडों को समायोजित करना या पढ़ने के लिए अधिक कठोर कटऑफ का पालन करने से मदद मिल सकती है। वैकल्पिक रूप से, एक सुझाए गए दृष्टिकोण सबसे अधिक संभावना विधानसभा पथ के लिए सबूत की तलाश में अधूरे क्षेत्रों को लंबे समय तक पढ़ता है, और फिर प्रवर और प्रवर अनुक्रमण का उपयोग करने वाले पथ की पुष्टि करना है। मैपिंग में मिनीमैप 2 का उपयोग करके पढ़ने का सुझाव दिया जाता है और पट्टी मैप किए गए के दृश्य के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करती है, साथ ही इकट्ठे हुए कॉन्टिग्स के साथ कंटिग लिंकेज47के लिए साक्ष्य प्रदान करते हैं।
पूर्ण जीनोम पैदा करने के लिए एक अतिरिक्त चुनौती कमांड-लाइन उपकरणों के साथ अपनेपन और आराम में निहित है। किसी भी उपयोगकर्ता को कम्प्यूटेशनल अवसर प्रदान करने के लिए कई बायोइंफॉर्मेटिक उपकरण विकसित किए जाते हैं; हालांकि, उनका उपयोग UNIX और प्रोग्रामिंग की मूल बातें के साथ एक समझ पर निर्भर करता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बंद जीनोम असेंबली उत्पन्न करने और उन्हें एनोटेट करने के लिए पूर्व कमांड-लाइन अनुभव के बिना व्यक्तियों को सक्षम करने के लिए पर्याप्त विस्तृत निर्देश प्रदान करना है।
The authors have nothing to disclose.
हम इस प्रोटोकॉल में योगदान के लिए डॉ मौतुसी जुबैदा इस्लाम और डॉ ल्यूक जॉयस को धन्यवाद देते हैं । हम भी उनकी प्रतिक्रिया और समर्थन के लिए डलास जीनोम केंद्र में टेक्सास विश्वविद्यालय को पहचानना चाहते हैं । इस काम को वेल्च फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, पुरस्कार संख्या-2030-20200401 N.J.D. को, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा, पुरस्कार संख्या R01AI116610 द्वारा K.P. को, और महिला स्वास्थ्य में Felecia और जॉन कैन कुर्सी द्वारा, पीईजे द्वारा आयोजित
Equipment: | |||
Bioanalyzer 2100 | Agilent | G29398A | Optional but recommended |
Centrifuge | Eppendorf | — | Any centrifuge for spinning conicals and microcentrifuge tubes (e.g. Models 5810R/5424R) |
Electrophoresis | BioRad Laboratories | 1645070 | |
Gel Imaging System | BioRad Laboratories | ChemiDoc models | |
Incubator | ThermoFisher Scientific | — | Any CO2 Incubator (e.g. Thermo Forma model 3110) |
Magnetic Rack | New England BioLabs | S15095 | 12-tube rack |
MinION | Oxford Nanopore Technologies | — | |
Nanodrop | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | Other Illumina models are acceptable |
Plate Reader | BioTek | — | Synergy H1 |
Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
Rotator | Benchmark Scientific | H2024 | |
Thermocycler | ThermoFisher Scientific | — | Any thermocycler for PCR reactions (e.g. ProFlex PCR system) |
Materials: | |||
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
10X TBE buffer | — | — | 1M Tris,1M Boric Acid,0.2M EDTA (pH 8.0) |
1429R primer | Sigma Aldrich (Custom oligos) | — | GGTTACCTTGTTACGACTT |
1kb Ladder | VWR | 101228-494 | |
1M Tris-Cl (pH 7.5) | ThermoFisher Scientific | 15567027 | |
6x Loading dye | Fisher Scientific | NC0783588 | |
8F primer | Sigma Aldrich (Custom oligos) | — | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG |
Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Agarose | BioRad Laboratories | 63001 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Anaerobe Pouch System – GasPak EZ | BD Diagnostic Systems | B260683 | |
Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | |
Brain Heart Infusion Broth | BD Diagnostic Systems | 212304 | |
CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar | BD Diagnostic Systems | L007357 | |
CHROMagar Orientation | BD Diagnostic Systems | PA-257481.04 | |
DNeasy Blood & Tissue | QIAGEN | 69504 | |
DreamTaq Master Mix | ThermoFisher Scientific | K1081 | |
Dry Anaerobic Indicator Strips | BD Diagnostic Systems | 271051 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Ethanol 200 Proof | Sigma Aldrich | E7023 | For molecular biology |
Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | BP130210 | |
Flow cell priming kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-FLP002 | |
Flow cell wash kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-WSH003 | |
Gel Extraction Miniprep Kit | BioBasic | BS654 | |
Ligation sequencing kit | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK109 | |
Lysozyme | Research Products International Corp | L381005.05 | |
Mutanolysin | Sigma Aldrich | M9901-5KU | |
Native barcoding expansion 1-12 | Oxford Nanopore Technologies | EXP-NBD104 | |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | New England BioLabs | M0367L | |
NEBNext FFPE DNA Repair Mix | New England BioLabs | M6630L | |
NEBNext quick ligation buffer | New England BioLabs | B6058S | |
NEBNext Ultra II End repair / dA-tailing module | New England BioLabs | E7546L | |
Nextera DNA CD Indexes | Illumina | 20018708 | |
Nextera DNA Flex Library Prep – (M) Tagmentation | Illumina | 20018705 | |
Nuclease-free water | Sigma Aldrich | W4502 | |
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
Quick T4 DNA Ligase | New England BioLabs | E6056L | |
R9 Flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106D | |
RNase A | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
Sheep Blood | Hemostat Laboratories | DS13250 | |
TE buffer | — | — | 10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0) |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Tryptic Soy Broth | BD Diagnostic Systems | 211825 | |
Software & Bioinformatic Tools: | |||
Bandage | — | — | https://rrwick.github.io/Bandage/ |
Center for Genomic Epidemiology | — | — | http://www.genomicepidemiology.org/ |
CLC Genomics Workbench 12 | QIAGEN | — | |
CRISPRcasFinder | — | — | https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/ |
FastQC | — | — | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ |
Geneious Prime | Geneious | — | |
gVolante (BUSCO) | — | — | https://gvolante.riken.jp/ |
Kbase Prokka Wrapper | — | — | https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release |
Minimap2 | — | — | https://github.com/lh3/minimap2 |
MinKNOW | Oxford Nanopore Technologies | — | |
NanoFilt | — | — | https://github.com/wdecoster/nanofilt |
NanoStat | — | — | https://github.com/wdecoster/nanostat |
PHASTER | — | — | https://phaster.ca/ |
Prokka | — | — | https://github.com/tseemann/prokka |
QUAST | — | — | http://quast.sourceforge.net/quast |
Trim Galore | — | — | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ |
Trimmomatic | — | — | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic |
Unicycler | — | — | https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length |