Automatiseret, høj-gennemløbsdetektering af bakteriel overholdelse af værtsceller
Summary
Påvisning af host-bakterielle patogen interaktioner baseret på fænotypisk tilslutning ved hjælp af høj-throughput fluorescens mærkning billeddannelse sammen med automatiserede statistiske analysemetoder muliggør hurtig evaluering af potentielle bakterielle interaktioner med værtsceller.
Abstract
Identifikation af nye bakteriepatogener er afgørende for menneskers sundhed og sikkerhed. Bakteriel tilslutning til værtsceller er et vigtigt skridt i bakterielle infektioner og udgør et kendetegn for potentiel trussel. Derfor kan undersøgelse af klæbeevnen af bakterier til værtsceller bruges som en komponent i bakteriel trusselsvurdering. En standardmetode til optælling af bakteriel tilslutning til værtsceller er at inkubere bakterier med værtsceller, høste klæbebakterierne, plade de høstede celler på faste medier og derefter tælle de resulterende kolonidannende enheder (CFU). Alternativt kan bakteriel overholdelse af værtsceller evalueres ved hjælp af immunofluorescence mikroskopi-baserede tilgange. De konventionelle strategier for gennemførelse af disse tilgange er imidlertid tidskrævende og ineffektive. Her beskrives en nyligt udviklet automatiseret fluorescensmikroskopibaseret billeddannelsesmetode. Når det kombineres med høj-throughput billedbehandling og statistisk analyse, metoden muliggør hurtig kvantificering af bakterier, der klæber til værtsceller. To bakteriearter, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa og Gram-positive Listeria monocytogenes og tilsvarende negative kontroller, blev testet for at demonstrere protokollen. Resultaterne viser, at denne tilgang hurtigt og præcist opregner klæbende bakterier og reducerer eksperimentelle arbejdsbelastninger og tidslinjer betydeligt.
Introduction
Bakteriel vedhæftning er en proces, hvor bakterier tillægger andre celler eller overflader. Vellykket etablering af infektion med bakterielle patogener kræver vedhæftning til værtsceller, kolonisering af væv og i nogle tilfælde invasion af værtsceller1,2,3. Nye smitsomme sygdomme udgør store trusler mod folkesundheden, som det fremgår af den seneste covid-19-pandemi4,5,6. Det er vigtigt, at nye eller nye patogener ikke umiddelbart kan skelnes ved hjælp af genomiske tilgange, især i tilfælde, hvor patogenet er blevet manipuleret til at undgå påvisning eller ikke indeholder genomiske signaturer, der identificerer det som patogent. Derfor kan identifikation af potentielle patogener ved hjælp af metoder, der direkte vurderer kendetegnende for patogenitet, som bakteriel overholdelse af værtsceller, spille en afgørende rolle i patogenidentifikation.
Bakteriel tilslutning til værtsceller er blevet brugt til at evaluere mekanismer af bakteriel patogenese i årtier1,7. Mikroskopisk billeddannelse8,9 og optælling af bakteriekolonidannende enhed (CFU)10,11,12,13 ved post-infektion plating er to veludviklede laboratoriemetoder til test af mikrobiel tilslutning og / eller infektion af værtsceller14. I betragtning af mikrometerskalastørrelsen af bakterieceller kræver optællingen af de klæbende bakterieceller generelt brug af avancerede mikroskopiteknikker med høj forstørrelse samt billeddannelsesmetoder i høj opløsning, herunder elektronmikroskopi, ekspansionsmikroskopi (ExM)15,16og tredimensionel billeddannelse17 . Alternativt kan optællingen af bakterier, der er bundet til eller internaliseret i værtsceller, udføres ved at plating fortyndingsserien af høstede bakterier på fast agar og tælle de resulterende CFO’er10,12,13. Denne metode er besværlig og indeholder mange manuelle trin, som indfører vanskeligheder med at etablere en standardiseret eller automatiseret procedure, der kræves til analyser med højoverførselshastighed 18,19. Derfor vil udviklingen af nye metoder til evaluering af vedhæftede værtsceller adressere de aktuelle begrænsninger i feltet.
En sådan metode er beskrevet her, der bruger automatiseret høj gennemløbsmikroskopi kombineret med høj gennemløbsbilledbehandling og statistisk analyse. For at demonstrere tilgangen blev der udført eksperimenter med flere bakteriepatogener, herunder Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk Gram-negativt bakteriepatogen hos mennesker, dyr og planter14,20, som ofte viser sig at kolonisere luftvejene hos patienter med nedsat værtsforsvarsfunktioner. Denne fremgangsmåde optimerede den mikroskopiske billedbehandlingsproces, der er beskrevet i tidligere undersøgelser14,20. Billeddannelsesdetektering blev forenklet af fluorescensmærkede værtsceller og bakterier for hurtigt at spore nærheden af dem, hvilket dramatisk reducerede mikroskopibelastningen for at få billeder i høj opløsning til at skelne bakterier. Derudover erstattede den automatiserede statistiske analyse af billeder i optælling af værtsceller og bakterier det hånd-on eksperiment med bakteriel CFU-plating for at estimere forholdet mellem klæbende bakterietal pr. Værtscelle. For at bekræfte kompatibiliteten af denne metode er der også testet flere bakteriestammer og værtscelletyper, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus og Klebsiella pneumoniae samt menneskelige navlestrengsveendotelceller (HUVECs), og resultaterne understøtter metodens mangfoldighed og effektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskriver en automatiseret tilgang til optælling af bakteriel vedhæftet fil til værtsceller. Den beskrevne tilgang har flere attraktive fordele i forhold til konventionelle metoder. For det første muliggør denne tilgang en præcis kvantificering af antallet af mikrobielle patogenceller, der er fastgjort til individuelle værtsceller. Det er vigtigt, at denne kvantificering kan udføres uden behov for besværlig bakteriehøst, serielle fortyndinger, plating på faste medier og bestemmelse af CFUs<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Dr. Kaite Zlotkowski af Biotek Inc. for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet under kontraktnummer W911NF1920013 til PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) og Indenrigsministeriet i henhold til kontrakt nr. 140D6319C0029 til PdF. Oplysningernes indhold afspejler ikke nødvendigvis regeringens holdning eller politik, og der bør ikke udledes nogen officiel godkendelse.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
