호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출
Summary
자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.
Abstract
신흥 세균 병원체의 식별은 인간의 건강과 보안에 매우 중요합니다. 숙주 세포에 세균적인 준수는 세균성 감염에 있는 필수적인 단계이고 잠재적인 위협의 특징을 구성합니다. 따라서, 숙주 세포에 박테리아의 준수를 검토하는 것은 세균 위협 평가의 구성 요소로 사용될 수있다. 숙주 세포에 세균 부착을 열거하는 표준 방법은 숙주 세포와 박테리아를 공동 배양하고, 부착 된 박테리아를 수확하고, 고체 매체에 수확 된 세포를 플레이트한 다음, 결과 식민지 형성 단위 (CFU)를 계산하는 것이다. 대안적으로, 숙주 세포에 대한 세균준수는 면역형광 현미경-현미경 기지를 둔 접근법을 사용하여 평가될 수 있다. 그러나 이러한 접근 방식을 구현하기 위한 기존의 전략은 시간이 많이 걸리고 비효율적입니다. 여기서, 최근에 개발된 자동화형 형광 현미경-현미경-이미징 방법이 설명된다. 높은 처리량 이미지 처리 및 통계 분석과 결합하면 호스트 셀을 부착하는 박테리아의 신속한 정량화를 가능하게 합니다. 2개의 세균성 종, 그람 음성 슈도모나스 아루기노사 및 그람 양성 리스테리아 단세포 유전자 및 상응하는 부정적인 대조군, 프로토콜을 입증하기 위하여 시험되었다. 결과는 이 접근방식이 부착된 박테리아를 신속하고 정확하게 예매하고 실험적인 워크로드와 적시성보다 현저히 감소시킨다는 것을 보여줍니다.
Introduction
세균성 접착은 박테리아가 다른 세포 또는 표면에 부착하는 과정입니다. 세균성 병원체에 의한 감염의 성공적인 확립은 세포를 숙주하는 유착, 조직의 식민지화, 그리고 어떤 경우에는 숙주 세포의 침입1,2,3을필요로 한다. 최근 COVID-19전염병4,5,6에서입증된 바와 같이 신흥 전염병은 주요 공중 보건 위협을 구성한다. 중요한 것은, 새로운 또는 신흥 병원체는 게놈 기지를 둔 접근을 사용하여 쉽게 분별되지 않을 수 있습니다, 병원체가 검출을 회피하기 위하여 설계되었거나 병원성으로 그것을 확인하는 게놈 서명을 포함하지 않는 경우에 특히. 따라서, 숙주 세포에 세균 준수 같이 병원성의 특징을 직접 평가하는 방법을 사용하여 잠재적인 병원체의 식별은 병원균 식별에 중요한 역할을 할 수 있습니다.
숙주 세포에 세균성 준수는 수십 년 동안 세균 성 병인의 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어 왔다1,7. 현미경 이미징8,9 및 세균식민지 형성 부(CFU)10,11,12,13의 열거형은 감염 후 도금에 의해 소주세포의 미생물 준수 및/또는감염을 테스트하기 위한 두 가지 잘 발달된 실험실 방법이다. 세균 세포의 마이크로미터 스케일 크기를 고려하여, 부착 세균 세포의 열거는 일반적으로 전자 현미경 검사법, 확장 현미경 검사법 (ExM)15,16및 3 차원 이미징17을 포함한 고해상도 이미징 접근법뿐만 아니라 고급 고배율 현미경 기술의 사용을 요구합니다. . 대안적으로, 숙주 세포 내에서 결합되거나 내면화된 박테리아의 열거량은 고체 천차에 수확된 박테리아의 희석 계열을 도금하고 결과 CFU10,12,13을계산하여 수행될 수 있다. 이 방법은 힘들며 고처리량 분석에 필요한 표준화또는 자동화된 절차를 수립하는 데 어려움을 야기하는 많은 수동 단계를 포함한다18,19. 따라서 호스트 셀 첨부 파일을 평가하기 위한 새로운 방법의 개발은 필드의 현재 제한을 해결합니다.
이러한 방법 중 하나는 높은 처리량 이미지 처리 및 통계 분석과 결합된 자동화된 높은 처리량 현미경 을 사용하는 것으로 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 접근법을 입증하기 위해, 인간, 동물,식물14,20의기회성 그람 음성 세균 병원균인 슈도모나스 아루기노사를포함한 여러 세균병원균을 실험하여 숙주 방어 기능이 손상된 환자의 호흡기를 식민지화하는 경우가 많았다. 이 접근법은 이전 연구에서 설명된 현미경 이미징 과정을최적화14,20. 이미징 검출은 형광 표지호스트 세포와 박테리아에 의해 단순화되어 그(것)들의 근접성을 급속하게 추적하기 위하여, 극적으로 박테리아를 구별하기 위한 고해상도 심상을 얻기 위하여 현미경 워크로드를 감소시켰습니다. 또한, 숙주 세포 및 박테리아를 세는 이미지의 자동 통계 분석은 숙주 세포당 부착 세균 수의 비율을 추정하기 위해 세균 CFU 도금의 수동 실험을 대체하였다. 이 방법의 호환성을 확인하기 위해, 다중 세균성 균주 및 숙주 세포 모형은 또한 리스테리아 단세포 유전자, 황색포도상구균, 바실러스 뇌엽서, 및 Klebsiella 폐렴과 같은, 또한 인간 적인 혈관 내피 세포 (HUVECs) 및 그 결과를 지원합니다, 및 결과는 체계의 다양성과 효과성을 지원합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 호스트 세포에 세균 부착을 예매하기 위한 자동화된 접근 법을 설명합니다. 설명된 접근 방식은 기존의 방법에 비해 몇 가지 매력적인 장점이 있습니다. 첫째, 이러한 접근법은 개별 숙주 세포에 부착된 미생물 병원균 세포의 수의 정확한 정량화를 가능하게 한다. 중요하게도, 이러한 정량화는 고성세균 수확, 직렬 희석, 고체 매체에 도금, CFUs10,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Biotek Inc.의 카이테 즐로코프스키 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 PdF에 계약 번호 W911NF1920013에 따라 국방부에 의해 지원되었다, 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA), 그리고 계약에 따라 내무부 140D6319 C0029 PdF에. 정보의 내용은 반드시 정부의 입장이나 정책을 반영하지 않으며, 공식적인 보증을 유추해서는 안됩니다.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
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