Les protéines et les ligands contenant des amines peuvent être liés de manière covalente aux polysaccharides activés par le réactif de cyanylation, le tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine (CDAP), pour former des conjugués protéine covalente (ligand)-polysaccharide. Cet article décrit un protocole amélioré pour effectuer une activation contrôlée du CDAP à 0 °C et faire varier le pH et effectuer une conjugaison ultérieure des polysaccharides activés.
Les vaccins conjugués sont des avancées remarquables en vaccinologie. Pour la préparation de vaccins conjugués polysaccharidiques, les polysaccharides peuvent être facilement fonctionnalisés et liés aux protéines porteuses du vaccin à l’aide du tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine (CDAP), un réactif cyanylant facile à manipuler. CdAP active les polysaccharides en réagissant avec les groupes hydroxyles glucidiques à pH 7-9. La stabilité et la réactivité du CDAP dépendent fortement du pH. Le pH de la réaction diminue également lors de l’activation en raison de l’hydrolyse du CDAP, ce qui fait du bon contrôle du pH la clé d’une activation reproductible. Le protocole d’activation CDAP original a été réalisé à température ambiante dans des solutions de pH 9 sans tampon.
En raison de la réaction rapide dans ces conditions (<3 min) et de la chute rapide du pH qui l’accompagne en raison de l’hydrolyse rapide du CDAP, il était difficile d’ajuster et de maintenir rapidement le pH de la réaction cible dans un court laps de temps. Le protocole amélioré décrit ici est effectué à 0 °C, ce qui ralentit l’hydrolyse CDAP et prolonge le temps d’activation de 3 min à ~15 min. La diméthylaminopyridine (DMAP) a également été utilisée comme tampon pour pré-ajuster la solution de polysaccharide au pH d’activation cible avant d’ajouter le réactif CDAP. Le temps de réaction plus long, associé à l’hydrolyse CDAP plus lente et à l’utilisation d’un tampon DMAP, facilite le maintien du pH d’activation pendant toute la durée du processus d’activation. Le protocole amélioré rend le processus d’activation moins frénétique, plus reproductible et plus facile à mettre à l’échelle.
Les vaccins conjugués, tels que ceux constitués de polysaccharides liés de manière covalente à une protéine porteuse, font partie des avancées remarquables en vaccinologie1,2. Les polysaccharides, en tant qu’antigènes indépendants des lymphocytes T, sont peu immunogènes chez les nourrissons et n’induisent pas la mémoire, le changement de classe ou la maturation d’affinité des anticorps3. Ces lacunes sont surmontées dans les vaccins conjugués polysaccharidiques4. Comme la plupart des polysaccharides n’ont pas de poignée chimique pratique pour la conjugaison, ils doivent d’abord être rendus réactifs ou « activés ». Le polysaccharide activé est alors soit directement lié à la protéine (ou protéine modifiée), soit fonctionnalisé pour une dérivatisation supplémentaire avant conjugaison4. La plupart des vaccins conjugués polysaccharidiques homologués utilisent l’amination réductrice ou la cyanylation pour activer les hydroxyles polysaccharidiques. Le bromure de cyanogène (CNBr), un réactif qui avait déjà été utilisé pour activer les résines de chromatographie, a été initialement utilisé pour la dérivatisation des polysaccharides. Cependant, CNBr nécessite un pH élevé, généralement ~ pH 10,5 ou plus, pour déprotoner partiellement les hydroxyles polysaccharidiques afin qu’ils soient suffisamment nucléophiles pour attaquer le groupe cyano. Le pH élevé peut être préjudiciable aux polysaccharides base-labile, et ni le CNBr ni le cyano-ester actif initialement formé ne sont suffisamment stables à un pH aussi élevé.
CDAP (tétrafluoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridine; Figure 1) a été introduit par Lees et al. pour être utilisé comme agent cyanylant pour l’activation des polysaccharides5,6. Le CDAP, qui est cristallin et facile à manipuler, s’est avéré activer les polysaccharides à un pH inférieur à celui du CNBr et avec moins de réactions secondaires. Contrairement au CNBr, les polysaccharides activés par cdap peuvent être directement conjugués aux protéines, ce qui simplifie le processus de synthèse. Les polysaccharides activés par cdAP peuvent être fonctionnalisés avec une diamine (p. ex. diamine hexane) ou un dihydrazide (p. ex., dihydrazide adipique, ADH) pour fabriquer des polysaccharides dérivés d’amino- ou d’hydrazide. Une forte concentration du réactif homobifonctionnel est utilisée pour supprimer la réticulation des polysaccharides. Les polysaccharides aminés peuvent ensuite être conjugués en utilisant l’une des myriades de techniques utilisées pour la conjugaison des protéines. Les polysaccharides dérivés de l’hydrazide sont souvent couplés à des protéines à l’aide d’un réactif de carbodiimide (par exemple, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDAC))7. Une optimisation supplémentaire de l’activation des polysaccharides CDAP a été décrite par Lees et al.8 et est incorporée dans le protocole décrit ici.
Vue d’ensemble de la conjugaison CDAP
Le protocole CDAP peut être conceptualisé en deux phases : (1) l’activation du polysaccharide et (2) la conjugaison du polysaccharide activé avec une protéine ou un ligand(Figure 2). Le but de la première étape est d’activer efficacement le polysaccharide, tandis que le but de la seconde est de conjuguer efficacement au polysaccharide activé. Le polysaccharide activé relie les deux étapes ensemble. Cette conceptualisation permet de se concentrer sur les éléments critiques de chaque étape. La figure 2 développe cette conceptualisation, montrant les réactions d’activation et de couplage souhaitées, ainsi que les réactions d’hydrolyse et les réactions secondaires.
Au cours de la phase d’activation, les trois préoccupations majeures sont la stabilité du CDAP, la réaction du CDAP avec les hydroxyles de polysaccharide et la stabilité du polysaccharide activé(Figure 3). L’hydrolyse CDAP augmente avec le pH, tout comme l’hydrolyse du polysaccharide activé et les réactions secondaires. Cependant, la réaction CDAP avec le polysaccharide est facilitée par l’augmentation du pH. L’activation efficace des polysaccharides avec CDAP nécessite un équilibre entre 1) la réactivité du polysaccharide et du CDAP et 2) l’hydrolyse et les réactions secondaires du réactif et du polysaccharide activé.
Dans le protocole d’activation CDAP original décrit par Lees et al.5,l’activation CDAP des polysaccharides a été réalisée à température ambiante dans une solution de pH 9 sans tampon. Le taux d’activation s’est avéré rapide dans cette condition, et l’activation serait terminée dans les 3 minutes. La réaction s’est également accompagnée d’une hydrolyse rapide du CDAP, provoquant une chute rapide du pH de la solution réactionnaire sans tampon. Il était difficile d’augmenter rapidement et de maintenir le pH de réaction à la valeur cible dans un laps de temps aussi court. Dans le protocole décrit, l’activation a été effectuée en ajoutant du CDAP à partir d’une solution stock de 100 mg/mL à la solution de polysaccharide sans tampon. Le pH a été relevé 30 s plus tard avec « un volume égal de 0,2 M de triéthylamine ». La protéine à conjuguer a ensuite été ajoutée après 2,5 minutes à la réaction d’activation. Notamment, le pH de l’étape d’activation n’était pas bien contrôlé et dépassait très probablement initialement le pH cible. La réaction rapide nécessitant un ajustement rapide du pH a rendu le processus d’activation difficile à contrôler et difficile à mettre à l’échelle.
Contrairement au protocole original, le protocole modifié décrit ici présente deux améliorations majeures. Tout d’abord, le pH de la solution de polysaccharide est pré-ajusté pour cibler le pH d’activation, en utilisant le DMAP comme tampon, avant l’ajout de CDAP. DMAP a un pKa de 9,5 et a donc un bon pouvoir tampon autour de pH 9, et contrairement à beaucoup d’autres tampons, DMAP n’a pas été trouvé pour favoriser l’hydrolyse CDAP8. De plus, le DMAP est déjà un intermédiaire de procédé et n’ajoute donc pas de nouveau composant au mélange réactionnel. Le préréglage du pH avant l’ajout de CDAP élimine la grande variation de pH au début de la réaction et permet un maintien plus efficace du pH cible pendant la réaction. La deuxième amélioration consiste à effectuer la réaction d’activation à 0 °C, où le taux d’hydrolyse CDAP est nettement plus lent que celui à température ambiante. Avec la demi-vie plus longue du réactif à 0 °C, le temps d’activation est augmenté de 3 min à 15 min pour compenser le taux d’activation plus lent à la température inférieure. Le temps de réaction plus long, à son tour, facilite le maintien du pH de la réaction. L’utilisation de 0 °C ralentit également la dégradation des polysaccharides sensibles au pH, ce qui permet de préparer des conjugués de ce type de polysaccharide. Les améliorations apportées au protocole rendent le processus d’activation moins frénétique, plus facile à contrôler, plus reproductible et plus facile à mettre à l’échelle.
Cet article décrit le protocole amélioré pour effectuer l’activation CDAP contrôlée du polysaccharide à 0 °C et à un pH cible spécifié et effectuer une dérivatisation ultérieure des polysaccharides activés avec de l’ADH. On décrit également un dosage de l’acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS), basé sur la méthode de Qi et al.9, pour la détermination du taux d’hydrazide sur le polysaccharide modifié. Un dosage modifié pour les hexoses à base de résorcinol et d’acide sulfurique10 est également décrit, qui peut être utilisé pour déterminer une gamme plus large de polysaccharides. Pour plus d’informations sur l’activation et la conjugaison cdap, le lecteur est renvoyé aux publicationsantérieures5,6,8 de Lees et al.
Le CDAP est un réactif pratique pour dévatiser et conjuguer les polysaccharides. Cet article décrit la méthode générale d’utilisation du CDAP pour dévatiser les polysaccharides avec des hydrazides (PS-ADH) et intègre des améliorations récemment publiées8. Tout d’abord, la technique souligne l’importance de maintenir le pH cible pour contrôler le processus d’activation. Nous avons constaté que bien que de nombreux tampons courants interfèrent avec la réaction d’activation du CDAP, le DMAP pouvait être utilisé avec succès comme tampon pour gérer le pH8. De plus, le DMAP est déjà un sous-produit de réaction de l’activation du CDAP. Enfin, la mise en mémoire tampon de la solution de polysaccharide avec du DMAP avant l’ajout du CDAP facilite le ciblage précis et le maintien du pH de la réaction. Comme nous le décrivons, il est utile d’ajuster le pH de la solution centrale concentrée de DMAP de telle sorte que, lorsqu’elle est diluée, elle atteigne le pH ciblé. Deuxièmement, l’exécution du processus dans le froid a ralenti le temps de réaction, rendant le processus d’activation moins frénétique et plus indulgent. Une température plus basse a diminué le taux d’hydrolyse CDAP et le temps d’activation optimal à pH 9 passe de ~3 min à ~15 min. De plus, moins de CDAP est nécessaire pour atteindre le même niveau d’activation que lorsqu’il est effectué à température ambiante.
Les polysaccharides dérivés de l’ADH peuvent être conjugués à des protéines à l’aide de carbodiimides (par exemple, EDAC)7. Par exemple, plusieurs vaccins homologués contre Haemophilus influenzae b (Hib) utilisent le polyribosylribitolphosphate (PRP) dérivé de l’ADH pour se conjuguer à l’anatoxine tétanique à l’aide de l’EDAC. CNBr a été initialement utilisé, mais CDAP est un réactif beaucoup plus facile à utiliser à cette fin. D’après notre expérience, une bonne plage cible pour la dérivatisation de l’ADH est de 10 à 30 hydrazides par polysaccharide de 100 kDa ou d’environ 1 à 3% d’ADH en poids.
Le même procédé peut être utilisé pour dévatiser les polysaccharides avec des amines primaires en substituant l’ADH à une diamine. Il est recommandé d’utiliser l’hexane diamine pour dévatiser les polysaccharides avec des amines8. Le polysaccharide aminé (PS-NH2) peut être conjugué à l’aide de réactifs développés pour la conjugaison des protéines11. Typiquement, le PS-NH2 est dérivé avec un maléimide (par exemple, l’ester de succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) ou N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS)), et la protéine est thiolée (par exemple, avec le propionate de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)(SPDP)). La chimie thiol-maléimide est très efficace.
Les protéines peuvent également être directement couplées aux polysaccharides activés par le CDAP via l’ɛ-amine sur les lysines. Bien que le protocole d’activation utilisé soit généralement similaire à celui décrit ici, il est nécessaire d’optimiser le niveau d’activation, la concentration en polysaccharides et en protéines, ainsi que le rapport protéine/polysaccharide5,6,8.
Le dextran est l’un des polysaccharides les plus faciles à activer avec le CDAP en raison de sa densité relativement élevée de groupes hydroxyles, mais certains polysaccharides, tels que l’antigène Vi, peuvent être difficiles. Par conséquent, il n’existe pas de « meilleur » protocole unique pour la conjugaison CDAP directement aux protéines. Nous suggérons d’abord de développer un protocole pour atteindre des niveaux appropriés d’activation, tels que déterminés par l’étendue de la dérivatisation de l’hydrazide, puis de procéder à la conjugaison directe des protéines en polysaccharide activé par CDAP.
The authors have nothing to disclose.
Le travail décrit ici a été financé par Fina Biosolutions LLC.
Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
Analytical balance | |||
Autotitrator or electronic pipet | |||
Beaker 2-4 L | |||
CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
Flake ice | |||
HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
NaCl | VWR | BDH9286 | |
NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
pH meter | |||
pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
pH temperature probe | |||
Pipets & tips | |||
Saline or PBS | |||
Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
Small ice bucket | |||
Small spatula | |||
Stir plate | |||
Resorcinol assay | |||
Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
DI water | |||
Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
Heating block | |||
Nitrile gloves | VWR | ||
Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
Resorcinol | Sigma | 398047 | |
Sugar standard | As appropriate | ||
Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
Timer | |||
TNBS assay | |||
Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |