Summary

Исследование фагоцитоза лейшмании с помощью конфокальной микроскопии

Published: July 29, 2021
doi:

Summary

Механизм, связанный с фагоцитозом при инфекции Leishmania , остается плохо изученным. Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами.

Abstract

Фагоцитоз — это организованный процесс, который включает в себя различные этапы: распознавание, связывание и интернализацию. Профессиональные фагоциты поглощают паразитов Лейшмании путем фагоцитоза, состоящего из распознавания лигандов на поверхностях паразитов несколькими рецепторами клеток-хозяев. Связывание лейшмании с мембранами макрофагов происходит через рецептор комплемента типа 1 (CR1) и рецептор комплемента типа 3 (CR3) и рецепторы распознавания образов. Липофосфогликан (LPG) и гликопротеин 63 кДа (gp63) являются основными лигандами, участвующими во взаимодействиях макрофагов и лейшмании . После первоначального распознавания лигандов паразитов рецепторами клеток-хозяев паразиты интернализируются, выживают и размножаются в паразитофорных вакуолях. Процесс созревания вакуолей, индуцированных лейшманией, включает в себя приобретение молекул из внутриклеточных везикул, включая мономерный G-белок Rab 5 и Rab 7, лизосомально-ассоциированный мембранный белок 1 (LAMP-1), лизосомно-ассоциированный мембранный белок 2 (LAMP-2) и микротрубочко-ассоциированный белок 1A/1B-легкая цепь 3 (LC3).

Здесь мы описываем методы оценки ранних событий, происходящих во время взаимодействия лейшмании с клетками-хозяевами с использованием конфокальной микроскопии, включая (i) связывание,ii) интернализацию и (iii) созревание фагосом. Добавляя к совокупности знаний, окружающих эти детерминанты исхода инфекции, мы надеемся улучшить понимание патогенеза инфекции Leishmania и поддержать возможный поиск новых химиотерапевтических целей.

Introduction

Лейшманиоз является запущенным тропическим заболеванием, вызываемым простейшими паразитами рода Leishmania, приводящим к широкому спектру клинических проявлений у позвоночного хозяина, включая кожный лейшманиоз, слизисто-кожный лейшманиоз и висцеральный лейшманиоз1. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более одного миллиарда человек находятся в группе риска, причем более одного миллиона новых случаев регистрируются в год2.

Leishmania spp. являются облигатными внутриклеточными простейшими, которые выживают внутри клеток-хозяев, включая моноциты, макрофаги и дендритные клетки3. Взаимодействие лейшмании и макрофагов представляет собой сложный процесс, который включает в себя несколько рецепторов клеток-хозяев и лигандов паразитов либо путем прямого взаимодействия, либо путем опсонизации с участием рецепторов комплемента 4,5. Классические поверхностные рецепторы, такие как CR1, CR3, манноза-фукоза, фибронектин, толл-подобные и поглотители рецепторов, опосредуют прикрепление паразитов к макрофагам 6,7,8. Эти рецепторы распознают молекулы на поверхности лейшмании, включая гликопротеин 63 кДа (gp63) и гликолипидный липофосфогликан (LPG)9. Это наиболее распространенные молекулы на поверхности промастиготов и играют важную роль в подрыве иммунного ответа хозяина, способствуя установлению паразитарной инфекции в клетках млекопитающих10. После того, как поверхностные лиганды паразитов связываются с рецепторами макрофагов, F-актин накапливается на клеточных поверхностях млекопитающих, окружающих паразитов по мере их фагоцитоза. Впоследствии это приводит к образованию паразитарно-индуцированного компартмента, называемого паразитофорной вакуолей (PV), который представляет фаголисосомальные признаки11. Попав внутрь этих фаголизосом, паразиты претерпевают несколько изменений, необходимых для выживания и размножения3.

Биогенез PV представляет собой высоко регулируемый процесс мембранного трафика, критически важный для внутриклеточной выживаемости этого патогена12. Образование этого компартмента происходит в результате последовательных слияний между фагосомами и компартментами эндоцитарного пути хозяина. Классические исследования клеточной биологии показали, что созревание PV включает в себя приобретение мономерного G-белка Rab 5 и rab 7 белков, которые в основном связаны с ранним и поздним созреванием эндосом соответственно13. Кроме того, эти компартменты приобретают лизосомно-ассоциированные мембранные белки 1 и 2 (LAMP 1, LAMP 2), основные белковые составляющие лизосомальной мембраны и микротрубочки-ассоциированный белок 1A/1B-световая цепь 3 (LC3), аутофагосомный маркер14. Несмотря на кажущееся сходство, кинетика PV-образования15,16 и морфология этих компартментов варьируются в зависимости от вида Leishmania. Например, инфекция, вызванная L. mexicana или L. amazonensis, вызывает образование крупных компартментов, содержащих большое количество паразитов17. Напротив, другие виды, такие как L. braziliensis и L. infantum, образуют более мелкие вакуоли, которые обычно содержат только одного или двух паразитов в каждой вакуоле18.

Несмотря на эти знания, связанные с взаимодействием клетки-хозяина и лейшмании, первоначальные события, вызванные контактом между рецепторами хозяина и лигандами паразитов, не были полностью выяснены. Эти события, как известно, являются детерминантами исхода заражения паразитами и зависят от видов паразитов, типа рецепторов клеток-хозяев, набираемых для распознавания паразитов, и активации сигнальных путей макрофагов19,20. Поэтому важно идентифицировать молекулы, участвующие в биогенезе Индуцированных Лейшманией ПВ, и определить роль (роли), которую играют эти молекулы в установлении инфекции и исходе. Здесь мы описываем метод мониторинга ранних событий, происходящих во время фагоцитоза лейшмании, включая связывание, интернализацию, образование и созревание фагосом. Эта работа может помочь прояснить участие PLC, Akt, Rab5, Rab7 и LC3 в формировании PV, индуцированных различными видами Leishmania. Важно отметить, что этот протокол может быть использован для исследования участия других белков, участвующих в pv-созревании. Будущие исследования расширят знания, связанные с механизмами, участвующими во взаимодействии клеток лейшмании и хозяина, и внесут вклад в разработку новых химиотерапевтических стратегий.

Protocol

Клетки были получены от здоровых доноров после утверждения процедур Национальными комитетами по этике исследований (ID: 94648218.8.0000.0040). 1. Клеточные культуры Макрофаги, полученные из моноцитов человекаПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить макрофаги человеческого моноцитарног…

Representative Results

Этот отчет направлен на оценку ранних событий, происходящих во время фагоцитоза L. braziliensis , выделенного у пациентов с L . braziliensis-LCL или L. braziliensis-DL формой CL. Используя конфокальную микроскопию, мы исследовали основные события, связанные с фагоцитозом паразитов: связывание, ин?…

Discussion

Взаимодействие лейшмании и макрофага является сложным процессом и включает в себя несколько этапов, которые могут влиять на развитие заболевания5. Чтобы лучше понять механизмы, участвующие во взаимодействии неопсонизированной лейшмании и клеток-хозяев, мы опис?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Институт Гонсалу Мониса, Фиокрус Баия, Бразилия и отдел микроскопии за помощь. Эта работа была поддержана INOVA-FIOCRUZ номером 79700287000, P.S.T.V. владеет грантом на продуктивность в исследованиях от CNPq (305235/2019-2). Плазмиды были любезно предоставлены Маурисио Теребизником, Университет Торонто, Калифорния. Авторы хотели бы поблагодарить Андриса К. Уолтера за редактирование на английском языке и помощь в редактировании рукописей.

Materials

2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific Tem varios no site
anti-LC3 antibody Novus Biologicals NB600-1384
Bovine serum albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific X
CellStripper Corning 25-056-CI
CellTracker Red (CMTPX) Dye Thermo Fisher Scientific C34552
Centrífuga Thermo Fisher Scientific
Ciprofloxacin Isofarma X
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific X
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) Leica Leica SP8
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270106
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) Olympus Olympus Lx73
Gentamicin Gibco 15750045
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) Gibco X
Histopaque Sigma 10771
M-CSF Peprotech 300-25
NH4Cl Sigma A9434
Normal goat serum Sigma NS02L
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector solution Lonza VPA-1007
Paraformaldehyde Sigma 158127
Phalloidin Invitrogen A12379
Phorbol myristate acetate (PMA) Sigma P1585
Phosphate buffer solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
ProLong Gold Antifade kit Life Technologies P36931
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Gibco 11875-093
Saponin Thermo Fisher Scientific X
Schneider's Insect medium Sigma S0146
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium pyruvate Sigma S8636
Triton X-100 Sigma X

References

  1. Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
  2. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
  3. Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
  4. Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
  5. Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
  6. Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
  7. Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
  8. Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
  9. Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
  10. Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
  11. Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
  12. Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
  13. Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
  14. Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
  15. Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
  16. Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
  17. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  18. Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
  19. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
  20. Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
  21. English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
  22. Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
  23. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  24. Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
  25. Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  26. Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
  27. Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
  28. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
  29. Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
  30. Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
  31. Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
  32. Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
  33. Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
  34. Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
  35. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
  36. Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
  37. Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
  38. Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
  39. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).

Play Video

Citer Cet Article
Paixão, A. R., Dias, B. R. S., Palma, L. C., Tavares, N. M., Brodskyn, C. I., de Menezes, J. P. B., Veras, P. S. T. Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62459, doi:10.3791/62459 (2021).

View Video