이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.
단백질 메틸 전달기(PRMTs)는 기질 단백질의 아르기닌 잔류물으로 메틸 군의 전달을 촉매한다. PRMT 제품군은 아르기닌 잔류물을 단백또는 대칭/비대칭으로 만들 수 있는 9명의 구성원으로 구성됩니다. 다양 한 단백질의 아르기닌 메 틸화의 다른 종류를 인식 하는 여러 항 체사용할 수 있습니다.; 따라서, PRMT 활성 바이오마커 의 개발을 위한 도구를 제공한다. PRMT 항체 기반 의 약은 겹치는 기판 및 모티프 기반 항체 특이성 때문에 도전적입니다. 이러한 문제와 개별 PRMT에 의해 기여 아르기닌 메틸화를 조사 하는 실험 설정 논의. 9개의 PRMT중 8개에 대한 바이오마커인 대표적인 기판의 신중한 선택을 통해 PRMT 활동 저술 패널이 설계되었다. 여기서, 세포 분석에 대한 프로토콜은 세포에서 PRMT 가족의 개별 구성원의 효소 활성을 정량적으로 측정하는 것으로 보고된다. 설명된 방법의 장점은 세포 배양 및 형광 웨스턴 블롯 기능을 가진 실험실에서 그들의 간단한 성과입니다. 기판 특이성 및 선택된 항체 신뢰성은 녹다운 및 과발현 접근법으로 완전히 검증되었다. 분석 바이오마커 및 항체의 상세한 지침 외에도 PRMT를 위한 억제제 도구 화합물 수집의 사용에 대한 정보도 제공됩니다.
아르기닌 메틸화는 단백질-단백질 및 단백질-RNA 상호 작용을 조절하는 중요한 번역 후 변형으로, 따라서 사전 mRNA 접합, DNA 손상, 전사 반응 및 성장 인자 매개 변환1,2와같은 다양한 세포 공정에서 중요한 역할을 한다. 아르기닌은 단백질 아르기닌 메틸트랜스퍼라아제(PRMT)에 의해 메틸화되어 모노메틸 아르기닌(Rme1), 비대칭 디메틸라르기닌(Rme2a), 또는 대칭 디메틸라르기닌(Rme2s)3을생성한다. 메틸화 유형에 기초하여, PRMT는 단일 및 비대칭 디메틸화를 촉매하는 유형 I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 및 8)의 세 그룹으로 분류됩니다. 모노 및 대칭 디메틸화를 촉매하는 유형 II (PRMT5 및 PRMT9); 및 유형 III (PRMT7), 이는 단지 단종 아르기닌3을할 수 있습니다.
시판되는 아르기닌 메틸화 특이적 항체의 수가 증가함에 따라, PRMT 활성은 서양 블로팅을 사용하여 측정될 수 있다. 형광계 웨스턴 블롯은 더 큰 동적 범위와 선형성, 높은 감도, 멀티플렉스4를허용하기 때문에 화학 발광 검출보다 바람직한 기술이다. 단백질 메틸화 수준을 정량화하려면 메틸화 신호의 정상화가 총 단백질 수준으로 정량화됩니다. 상이한 숙주 종(예를 들어, 마우스 및 토끼)에서 제기된 총 및 메틸화 단백질에 대한 항체를 선택함으로써, 상이한 형광으로 표지된 이차 항체를 사용할 수 있고 두 항체모두에 대한 신호가 동일한 샘플 대역에서 결정될 수 있다. 메틸-아르기닌 항체는 메틸 아르기닌이 특정 맥락에서 발견되는 단백, 비대칭 또는 대칭적으로 희석된 단백질을 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. PRMTs메틸레이트 글리신 및 아르기닌이 풍부한 모티프의 대다수가 기판5내에서 발생했기 때문에, 다름또는 비대칭, 대칭 디메틸-아르기닌 글리신 반복을 포함하는 펩티드에 대해 각각 D5A12, ASYM24 또는 ASYM25, 및 SYM111, SYM11, SYM11, SYM11 등이 들어 있었다. 다른 메틸-아르기닌 항체는 이러한 특정 문맥에서 메틸-아르기닌의 검출을 용이하게 하는 반복적인 맥락에서 비대칭, 대칭 디메틸 및 단메틸 아르기닌을 포함하는 펩티드 라이브러리에 대해 생성되었다6. 또한 히스톤 H4R3me2a 또는 BAF155-R1064me2a와 같은 메틸화의 선택적 검출을 가능하게 하는 단일 단백질에 특정 아르기닌 마크를 인식하는 항체의 수가 증가하고 있다.
PRMT 세포 소의를 위한 공구로 이용될 수 있는 몇몇 상업적으로 유효한 PRMT 억제제가 있습니다. 그러나, 그들 모두는 철저하게 선택성과 오프 대상 효과에 대한 특성화하고 일부는주의해서 사용해야합니다. 구조 게놈 컨소시엄은 학술 실험실 및 제약 파트너와 협력하여 과학 계의 제한없이 사용할 수있는 강력하고 선택적이며 세포 투과성 PRMT 억제제 (화학 프로브)를 개발했습니다. 이러한 억제제에 대한 정보는 https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics 및 https://www.chemicalprobes.org/ 찾을 수 있습니다. 화학 프로브는 체외 IC50 또는 Kd < 100 nM을 가진 소분자 억제제, 동일한 패밀리의 단백질보다 30배 이상 선택성, 그리고 1 μM에서 의한 세포 활성을 추가로, 각 화학 프로브는 의도된 표적7,8,9,10,11,12에대해 비활성인 근접 화학아날로그를갖는다.
이 프로토콜의 목표는 형광 서부 블롯 방법을 사용하여 개별 PRMT 가족 구성원의 세포 활성을 측정하는 것입니다. 여기에서 검증된 분석 바이오마커, 항체 및 강력한 세포 활성 억제제에 대한 자세한 정보와 성공적인 분석 구현을 위한 귀중한 전략이 제공된다.
여기서, PRMT 제품군의 구성원을 위한 상세한 세포 분석 프로토콜은 형광 서쪽 블로팅 방법을 사용하는 것으로 기술된다. 아르기닌 메틸화의 변화가 개별 PRMT 손실 또는 촉매 억제에 따라 쉽게 검출될 수 있고 다른 가족 구성원에 의해 보상될 수 없는 독특한 기판이 선택되었다. 일부 단백질은 다중 PRMTs(21,23)에의해 메틸화되며, 일부 PRMT가 주어진 단백질 기판24,25,26,27에서소량의 세포 마크만 기여하는 기판 특이성에 중첩을 제안하며, 예를 들어 PRMT8과 PRMT1모두 EWS의 메틸화에 기여한다. 따라서, 각 분석은 녹다운 및/또는 과발현 실험을 통해 기판 및 항체의 철저한 검증을 요구하고 잘 특징적인 선택적 억제제를 통해 추가 검증을 요구했다. PRMT 특이기는 메틸-아르기닌 마크 수준에 간접적으로 영향을 미칠 수 있는 감소된 세포 생존력 및 증식의 복합 효과를 피하기 위해 PRMT 손실/억제 후 2-3일 이내에 메틸화 마크 변화를 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. PRMT1, 4, 5, 7 및 9에 대한 고유 기판을 찾을 수 있었지만; PRMT3, 6, 8의 경우 기능 접근 방식을 채택해야 했습니다. 몇몇 아르기닌 메틸 특이적 항체는 각종 세포 표적을 위해 시험되었습니다, 그러나 PRMT3 및 PRMT6 녹다운의 3 일 안에 중요한 변경을 검출할 수 없었습니다; 따라서, 바이오마커 어약은 촉매비활성 돌연변이체와 함께 ectopically 발현된 효소를 사용하여 개발되었으며, 이는 기준기질 메틸화에 대한 대조군역할을 하였다. PRMT8은 가까운 PRMT1 동형 론이며 유사한 기판 기본 설정을 공유합니다. PRMT8 선택적 바이오마커를 식별할 수 없기 때문에 PRMT1 녹다운 세포의 분석이 개발되었으며, PRMT8은 EWS와 함께 공동 발현되었다. PRMT1은 또한 H4R3 비대칭 메틸화에 대한 주요 효소이므로, PrMT3 및 PRMT6 세포 분석제의 바이오마커로서 H4R3me2a를 사용하는 주요 효소이며, 기저 H4R3me2a 수준이 낮은 세포를 촉매 활성 돌연변이뿐만 아니라 촉매 활성 돌연변이체로 선택하였다. 내인성 소제가 선호되지만, 외인성 소는 몇몇 선택적PRMT억제제7,8,9의세포 효능을 시험하는 데 매우 귀중한 것으로 판명된다. PRMT 생물학에 대한 지식이 증가함에 따라 PRMT3, PRMT6 및 PRMT8에 대한 보다 구체적인 바이오마커 단백질을 찾아서 분해를 개선할 것으로 기대합니다.
검증된 항체및 적당한 통제의 사용은 PRMT 분석 성능에 중요합니다. 여기에 권장되는 모든 항체는 녹다운 및 과발현 실험에 의해 철저히 검증되었지만, 특히 다발성 항체의 경우 배치 대 배치 차이는 여전히 성능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 분석 신뢰성을 확인하기 위해 밀접하게 관련된 부정적인 제어와 함께 유전 방법 및 화학 프로브를 사용하는 것이 중요합니다. 또한 단백질 과발현이 필요한 PRMT 아세약의 경우, 야생형 단백질과 함께 촉매활성 돌연변이를 사용하여 기저 메틸화 수준을 결정하는 것이 중요합니다.
세포내 PRMT의 활성을 프로파일링하기 위한 정량적 분석의 이 수집은 기본적인 세포 배양 및 형광 서부 블로팅 기술만을 포함하는 최소한의 장비및 제한된 기술 적 전문 지식으로 신속하고 쉽게 구현될 수 있기 때문에 과학 계에 광범위하게 유용할 수 있습니다. PRMT에 대한 권장 항체 및 화학 프로브는 또한 주어진 ABPP 프로브의 적합성을 확립하고, 표적 참여를 모니터링하고, 경쟁ABPP 형식을 사용하여 오프 타겟 효과를 평가하기 위해 활성 기반 단백질 프로파일링(ABPP) 분석을 위해 사용될 수 있다. 여기에서 논의된 분석 발달 접근은 또한 단백질 lysine-메틸 전달효소 및 아세틸 전달효소와 같은 그밖 효소 가족을 위해 추정될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
구조 유전체학 컨소시엄은 애브비로부터 기금을 받는 등록 된 자선 단체 (없음 : 1097737)입니다. 바이엘 AG, 보링거 잉겔하임, 제넨테크, 온타리오 유전체 연구소 [OGI-196]를 통해 유전체 캐나다 [OGI-196], 혁신적인 의약품 이니셔티브 2 공동 착수 [EUbOPEN 보조금 875510]을 통해 EU와 EFPIA, 얀센, 머크 KGaA (일명 캐나다와 미국에서 EMD), 화이자, 테이크다 및 웰컴 트러스트 [106169 Z4].
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |