提供详细的说明,以建立一个开源的模块化氟度计,与许多低成本加热器兼容,以执行实时,定量等热核酸放大。
检测和量化核酸的传统方法依赖于聚合酶链反应 (PCR),需要使用昂贵的恒温器,对放大器进行集成荧光检测。同热核酸放大技术消除了热循环的需要:然而,荧光检测产品仍然需要实时,定量的结果。几款带有集成荧光检测的便携式同热加热器现已上市:然而,这些设备的成本仍然是资源有限环境中广泛采用的一大障碍。此处描述的是设计和组装由现成组件构建的模块化低成本氟度计的协议。氟度计采用紧凑的 3D 打印外壳,设计用于放置在可使用 PCR 管的市售热块上。此处描述的氟度计经过优化,可检测荧光乙异氰酸酯 (FITC) 染料,但该系统可与实时核酸放大反应中常用的染料一起进行修改。该系统的临床适用性通过用两种同热放大技术进行实时核酸检测来证明:重组聚合酶放大 (RPA), 用于检测商业套件中提供的阳性控制 DNA 和反向转录循环介质同热放大 (RT-LAMP),用于检测 SARS-CoV-2 RNA 的临床意义水平。
异热放大技术广泛应用于核酸的检测。与传统的PCR方法,需要热循环,同热放大允许核酸放大发生在一个单一的温度,从而使更快的时间,结果和更好的耐受性抑制剂1,2。同热放大的另一个主要好处是仪器复杂性降低。大多数同热放大反应只需要一个热块和一个检测模式-无论是通过荧光监测或端点检测实时检测,例如通过横向流动或凝胶电泳3,4。实时荧光检测通过检测由交错染料产生的荧光来完成,这些染料在双链DNA或淬火荧光探针在特定双链DNA序列存在的情况下激活。
虽然存在市售的台式同热荧光计,但许多氟化物缺乏检测实现的定制性。例如,许多设备需要特定或公司提供的耗材、推荐首选供应商或使用专有软件来获取广告结果。这些系统大多花费超过 5,000 美元,在资源有限设置中广泛使用存在重大障碍。此外,由于环境条件恶劣、备件供应链薄弱以及维护和维修所需的专用工具,低资源环境下的用户在维护高资源环境设备方面面临挑战。为了满足这一需求,这里描述的是一个模块化和低成本的氟度计的设计和组装,该氟计由现成的组件组成,封闭在紧凑的 3D 打印外壳(图 1A–C)中,具有两种可选配置。该设备的第一个配置使用市售的玻璃滤镜和二色镜来阻挡多余的背景光,总组装成本为 830 美元。虽然这些滤镜通常用于荧光成像系统,但更换昂贵的高档光学滤芯之前已被证明允许核酸检测6。氟度计的第二个配置集成了这些廉价的过滤器,并更换了φ1/2″光束分离器的二色镜,将系统的整体成本从 830 美元降低到 450 美元。
装配的代表性图像显示在 图 1 和图 2中的第一个配置中,但第二个配置的类似图像可以在 补充文件 6中找到。为了避免需要专门的光学对齐,光学系统指定了放置每个光学元件的区域,并且可以使用相对低端的 3D 打印机进行,从而广泛使用该设计。两种配置在构造和组装上的唯一区别是用于 3D 打印的文件和放置在外壳中的光学组件。两个系统的 3D 打印外壳的外部尺寸相同。 表1显示了两个系统的成本比较。
如图1A所示,为了保持小的外形,荧光计由Φ1/2″(±12.5毫米)光学元件组成,并配有紧凑的照明和检测,通过PCR管的顶部测量信号。图1中的系统旨在检测峰值激发和发射波长分别为近490纳米和525纳米的染料,包括FITC和密切相关的染料,如SYBR和SYTO-9,它们通常用作实时核酸放大反应7、8的记者。兴奋源、光学滤光片和探测器可以根据需要轻松替代与不同荧光染料兼容的组件。核酸放大反应通常在 PCR 管中执行,氟度计设计用于放置在任何可商用的热块上,该热块可容纳 PCR 管 (图 1D),从而实时监控同热反应。大多数生物医学实验室都提供适当的隔热块,可以低于 500 美元的价格购买。
使用单板计算机为控制成像技术提供低成本的护理点替代方案,此前已有9项证明。基于此工作,在此协议中,单板计算机供电的图形用户界面 (图 1D)用于便于实时数据记录和在护理点显示结果,从而无需笔记本电脑处理或可视化数据。荧光测量通过I2C协议从光传感器转移到微控制器,然后通过串行通信提供给单板计算机。通过在小型面包板上简化布线和焊接,为照明和数据传输提供电气连接,从而消除了对专用印刷电路板 (PCB) 的需求。运行氟度计所需的软件可通过开源软件框架获得,运行设备所需的代码在 补充编码文件中提供。完整的荧光计可以组装在450美元到830美元之间,结果表明,它提供了准确可靠的荧光测量,以监测核酸的实时等热放大。
这里描述的是一种开源、低成本、模块化、便携式荧光计,用于定量荧光检测等热放大反应。开源项目可通过现成的更换部件进行快速、廉价的维护,并允许用户根据模块化设计灵活地使系统适应其需求。该协议描述了组装机械、光学和电气部件以及验证光学性能的过程。此外,还证明了荧光计在监测两种不同类型的同热放大检测时的灵活性,其温度、体积和荧光要求显著不同,RPA exo 和 RT-LAMP。RPA 在 50 μL 反应中以 39 °C 进行,该反应利用序列特定的 FAM 标记探头进行荧光生成,而 RT-LAMP 在 25μL 反应量中以 65 °C 执行,并使用交错染料报告放大的 DNA 的存在。由于荧光测量是通过带有扁平帽的 PCR 管顶部进行的,因此荧光计能够从两个检测量中检测荧光,并且热量要求仅受选择的商业热块的限制。此外,由于基于染料和探针的荧光信号生成方法,RT-LAMP产生的荧光强度几乎比 RPA 中产生的荧光强度大。但是,选择的光学传感器的动态范围可以检测和量化信号,基线减法算法可以解释这些差异,以产生可靠的荧光读数。
为了促进技术传播和最大限度地降低潜在的维护成本,采用了与不同环境中广泛使用的加热器兼容的模块化设计。在当前协议中,使用了一个普通的干块加热器:同样的光学和电气设计可以很容易地适应其他市售加热器。如果要使用另一个干块加热器,则需要对 3D 外壳设计进行最小的更改。具体来说,必须修改光学外壳 STL 文件的底部钉,以确保与其他商业热块的井正确对齐。虽然示例中显示的外壳印在相对低端的 3D 打印机上(参见 材料表),但应小心确保打印机分辨率和/或打印公差足以容纳光学组件和螺纹插入物。在提供的 STL 文件中,根据制造商指定的尺寸,在径向和轴向光学组件的两侧都添加了 0.01-0.02 英寸的公差。这确保了所有光学元件牢固地安装在打印中,并且外壳完全阻止多余的光线进入或逸出。为了确保适当的按压适合螺纹插入物,从 CAD 文件中制造商提供的直径中减去了 0.01-0.02 英寸的类似公差。
使用第一个氟度测量器配置成功监测了 RPA 反应,而使用任一配置可以监控 RT-LAMP 反应。改进了第一种配置的散射光排斥,以监测 RPA 反应中荧光探头产生的低荧光水平。相比之下,RT-LAMP 使用介相染料进行信号生成,从而产生更高的荧光强度,与使用摄影滤芯的第二个配置的较低动态范围兼容。用户应选择与其测定中的荧光信号生成元素交错染料或荧光探头相匹配的荧光计配置。
该系统的一个限制是,供暖是由一个通过标准墙口供电的市售热块提供的。该系统可以进一步开发,用于缺乏可靠电力供应的地区,包括便携式和可充电电池组,如其他组12所示。另一个限制是系统吞吐量相对较低,允许同时测量一次只有两个样本的荧光。外壳的多个打印可以放置在同一热块上,以增加吞吐量:但是,仅使用的光传感器具有四个独特的 I2C 地址。这限制了可以同时测量到的样本的最大数量为四个。需要具有更多独特 I2C 地址的不同光传感器,以进一步提高吞吐量。
The authors have nothing to disclose.
特别感谢切尔西·史密斯、梅根·张、埃米莉·纽瑟姆、赛·保罗和克里斯托弗·吴在样品准备方面给予的帮助。作者感谢卡罗琳·诺克逊的手稿修订。这项工作的资金由美国国际开发署通过国际开发署和美国国际开发署根据AID-OAA-A16-00032奖提供,由美国人民提供。
1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters. |
Blue LED – 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |
LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
Microcontroller | Arduino | Nano | |
Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts |