压力反射是自主神经系统响应血压变化的心率调节机制。我们描述了一种植入遥测发射器的手术技术,用于连续和同时测量小鼠的心电图和血压。这可以确定自发性压力反射敏感性,这是心血管疾病的重要预后标志物。
血压(BP)和心率(HR)都由自主神经系统(ANS)控制,并且由于反射机制而紧密交织在一起。压力反射是一种关键的稳态机制,可抵消动脉血压的急性短期变化,并将血压维持在相对狭窄的生理范围内。血压由位于主动脉弓和颈动脉窦的压力感受器感知。当血压改变时,信号被传递到中枢神经系统,然后传递到自主神经系统的副交感神经和交感神经分支以调节心率。血压升高导致心率反射下降,血压下降导致心率反射性增加。
压力反射敏感性(BRS)是动脉血压变化与相应心率变化之间的定量关系。 心血管疾病通常与压力反射功能受损有关。在各种研究中,已有减少BRS的报道,例如心力衰竭、心肌梗死或冠状动脉疾病。
BRS的测定需要来自BP和HR的信息,这些信息可以使用遥测设备同时记录。首先描述外科手术,首先将压力传感器插入左颈动脉并将其尖端定位在主动脉弓中以监测动脉压,然后皮下放置发射器和心电图电极。我们还描述了术后重症监护和镇痛药管理。经过两周的术后恢复后,在有意识和无拘无束的小鼠中进行长期心电图和血压记录。最后,我们包括高质量记录的示例以及使用序列方法分析自发压力感受器的敏感性。
动脉压力感受器反射是人类的主要反馈控制系统,它提供短期 – 也可能是长期1,2 – 动脉血压 (ABP) 控制。这种反射缓冲了对生理或环境触发因素的反应而发生的血压扰动。它提供心率、每搏输出量和总外周动脉阻力的及时反射变化。反射起源于主动脉弓和颈动脉窦的感觉神经末梢。这些神经末梢构成了动脉压力感受器。主动脉弓神经末梢的躯体位于结节神经节中,而颈动脉窦的神经末梢位于岩神经节中。反射是由血压升高触发的,血压升高拉伸并激活压力感受器神经末梢(图1A)。激活导致动作电位凌空抽射通过传入主动脉抑制器和颈动脉窦神经集中传递到心血管脑干核,例如孤束核和迷走神经背核。传入神经活动的变化反过来调节自主神经传出活动。压力感受神经活动增加会降低交感神经并增加副交感神经活动。因此,压力感受器激活的后果是心率,心输出量和血管阻力降低,它们共同抵消和缓冲血压升高3。相比之下,压力感受神经活动减少会增加交感神经并降低副交感神经活动,从而增加心率、心输出量和血管阻力,从而抵消血压的降低。
对人类和动物的大量研究表明,在运动4、睡眠5、热应激6或怀孕7等生理条件下,压力感受器反射可以调节。此外,有证据表明,在高血压、心力衰竭、心肌梗死和卒中等心血管疾病中,压力反射会长期受损。事实上,压力反射功能障碍也被用作几种心血管疾病的预后标志物8,9,10。此外,压力反射功能障碍也存在于ANS疾病中。鉴于压力感受器反射对健康和疾病状态的重要性,体内估计这种反射是自主神经和心血管研究的重要组成部分,具有某些严重的临床意义。
遗传小鼠系是心血管研究中必不可少的工具。这种小鼠系的体内研究为心血管生理学和病理生理学提供了有价值的见解,并且在许多情况下可作为心血管疾病的临床前模型系统。在这里,我们提供了一种在有意识的,无限制的,自由移动的小鼠中进行遥测体内ECG和BP记录的协议,并描述了如何使用序列方法从这些记录中确定压力反射敏感性(图1B)。应用的方法称为序列法,因为在 HR 的反射适应下,在 SBP 自发增加或减少期间,筛选收缩压 (SBP) 和 RR 间期的逐搏系列,以显示 3 次或更多次的短序列。该方法是测定压力反射敏感性的金标准,因为仅研究自发反射机制。该技术优于涉及侵入性程序(例如注射血管活性药物以诱导血压变化)的旧技术。
图 1:使用序列法进行压力反射和压力反射敏感性评估的示意图 。 (A)血压急剧升高期间的压力反射过程。位于主动脉弓和颈动脉窦的压力感受器可感觉到 ABP 的短期升高.该信息被传递到中枢神经系统,并诱导交感神经活动的减少,同时副交感神经活动的增加。位于窦房结区域的神经末梢释放乙酰胆碱诱导窦房结起搏器细胞中第二信使cAMP降低,从而降低心率。血压的短期下降会产生相反的效果。(B) 连续三个节拍的上行序列(左上图)和下序列(右上图)期间的BP曲线示意图。上升序列与RR间期的平行增加(左下图)相关,这相当于HR的降低。下降序列与RR间期的平行降低(右下图)相关,这相当于HR的增加。 请点击此处查看此图的大图。
该方法相对于替代方法的意义
在目前的工作中,我们提出了一个详细的协议来量化自发BRS,使用序列方法。这种方法利用通过心电图和血压遥测测量的自发血压和反射心率变化。这种方法的优点是,通过走进进行测量的房间,甚至通过注射药物所需的物理相互作用,可以在有意识的、自由移动的、不受约束的动物身上记录这两个参数,而不会打扰动物。这一点非常重要,因为已经清楚地表明,这种干扰会严重干扰心率和血压记录。例如,注射药物需要固定小鼠,这会导致最大应激反应,使HR增加到650-700 bpm。为了规避这些应激反应,先前已在麻醉小鼠中测定了BRS。然而,兽药中使用的标准麻醉剂(如氯胺酮/甲苯噻嗪或异氟烷)会诱发心动过缓并影响自主神经反射反应,从而限制了这些方法的有效性和结果的解释。为了部分克服这些限制,使用了植入式给药装置,即渗透泵,其可以将药物释放到腹膜腔中。然而,使用渗透泵,不可能应用限制此类装置应用的确定剂量的药物推注。或者,使用复杂的输液导管17 可以植入小鼠体内以给药。然而,这些导管难以处理,并且需要与植入遥测设备所需的手术技能相当的手术技能,而与自发性BRS的测量相比,产生的科学结果较少。除了与使用注射药物测量BRS相关的技术问题外,还存在与药物作用本身相关的一些限制。确定 BRS 的传统方法包括推注血管活性药物。然而,推注血管收缩剂(例如去氧肾上腺素)或血管扩张剂(例如硝普钠)被认为是反射性心率适应血压变化的过度和非生理刺激18.压力感受器反射的自发活动也可以使用光谱方法量化。其中一种方法通过计算特定频带中心率变化与血压变化之间的比率来评估频域中的BRS18,19.其他光谱方法包括确定BP和HR的传递函数或BP和HR之间相干性的量化20,21.这些方法还需要遥测采集自发血压和心率参数,虽然它们适用于确定自发BRS,但它们需要密集的计算工具并且难以应用。此外,所有频谱方法都存在非平稳信号妨碍频谱方法应用的限制。特别是,通过要求患者停止呼吸,可以在人类患者中减少由呼吸节律诱导的光谱峰值,而这在小鼠中显然是不可能的。因此,小鼠的信噪比通常相当低。鉴于上述方法的局限性,我们倾向于确定小鼠BRS的序列方法。这种方法的一个相当大的优点是它是一种非侵入性技术,可在现实生活中提供自发BRS的数据。22.另一个重要的一点是,使用序列方法分析的序列的持续时间非常短,涉及3-5次。迷走神经对HR的反射调节非常快,并且在这些序列的时间范围内。因此,序列法非常适合评估迷走神经对BRS的贡献。相比之下,交感神经系统的调节要慢得多。事实上,在这些短序列中,交感神经系统的活动可以假设几乎是恒定的。因此,该方法被定制为选择性地检测迷走神经活动驱动的HR的反射变化。
BRS数据的解释
对于BRS功能障碍或BRS数据本身的解释,重要的是要考虑压力感受器反射所涉及的各个功能水平。在神经元水平上,反射的传入、中枢或传出成分可能会受到影响23。在心血管水平上,窦房结对ANS输入的反应可能降低或过度11,24。每个级别的变化都可能导致BRS的变化。为了剖析神经元和/或心脏机制是否负责观察到的BRS,心脏或神经元特异性基因缺失的变化,可以使用敲低或基因编辑方法。
协议中的关键步骤
该方案中最复杂和最关键的步骤是左颈动脉的准备和插管(步骤2.3)。尾部闭塞缝合线的张力必须足够高,以便在插管前完全停止血流。否则,即使是插管过程中少量的血液泄漏也会严重限制能见度,甚至导致小鼠流血致死。插管应在第一次尝试时成功。但是,在第一次尝试失败后,仍然可以仔细重试插管。
从颈部到左胁的中线切口和皮下隧道(步骤2.3)必须足够大,以便轻松引入发射器而不会用力,但也必须尽可能小以保持发射器就位。否则,需要用缝合材料或组织粘合剂将其锁定到位。由于小鼠的皮肤非常娇嫩,如果发射器的隧道太小,就会发生皮肤坏死。
如果心电图电极太长而无法放入皮下隧道(步骤2.4),则需要通过将电极缩短到适当的长度来形成新的尖端。电极必须在引线的整个长度上平放在主体上。过长的电极会干扰动物,它们会试图打开伤口以去除递质,导致组织刺激和伤口裂开的风险。当然,太短的引线不能延长,在这种情况下,电极可能无法以符合Einthoven II配置的方式定位。因此,我们建议确定相同性别、体重和遗传背景的死小鼠心电图导联的最佳长度。
如果小鼠没有正常的昼夜节律,则应在递质植入后给予更长的恢复时间,并且这不是所研究的小鼠系的表型(步骤2.7)。昼夜节律紊乱的另一个原因可能是测量期间动物设施或进入房间的人员的声学隔离不足。
心电图、血压和BRS数据分析很简单(步骤2.8)。最关键的一步是从数据分析中排除异位搏动、窦性停搏、心律失常发作或信号低质量的部分。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了德国研究基金会[FE 1929/1-1和WA 2597/3-1]的支持。我们感谢Sandra Dirschl提供的出色技术援助和Julia Rilling的兽医建议。
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
Forceps – Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
Forceps – straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
Data acquisition and analysis | Source | ||
DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |