Этот протокол описывает применение иммобилизации образца с использованием сгустков Фибрина, ограничивая дрейф, и позволяя добавление и вымывание реагентов во время живой визуализации. Образцы переносятся на каплю фибриногена, содержащего культурную среду на поверхности крышки, после чего полимеризация индуцируется добавлением тромбина.
Дрозофила является важной модельной системой для изучения широкого спектра биологических вопросов. Различные органы и ткани из различных стадий развития мухи, такие как воображаемые диски, личиночных мозговых или яичных камер взрослых женщин или взрослого кишечника могут быть извлечены и хранятся в культуре для визуализации с замедленной микроскопии, обеспечивая ценную информацию в клеточной и биологии развития. Здесь мы подробно описываем наш текущий протокол вскрытия личинок Drosophila, а затем представляем наш текущий подход к иммобилизации и ориентации личинок мозга и других тканей на стеклянной крышке с использованием сгустков Фибрина. Этот метод иммобилизации требует только добавления фибриногена и тромбина в культурную среду. Он подходит для изображений с высоким разрешением времени на перевернутых микроскопах нескольких образцов в одном и том же культуре блюда, сводит к минимуму боковой дрейф, часто вызванный движениями стадии микроскопа в многоточечных посещения микроскопии и позволяет добавление и удаление реагентов в ходе визуализации. Мы также представляем на заказ макросы, которые мы обычно используем для коррекции дрейфа и извлечения и обработки конкретной количественной информации из анализа замедленного действия.
Drosophila продолжает оставаться важной модельной системой для изучения широкого спектра биологических вопросов и преуспел в продвижении знаний во многих дисциплинах на протяжении десятилетий. Одной из особенностей, которая делает его особенно выделяются является то, что он особенно хорошо подходит для живой визуализации. Способность контролировать субклеточные процессы или поведение клеток и тканей в режиме реального времени продолжает способствовать созданию ключевых концепций, имеющих отношение к клеточной и биологии развития. Многие успешные протоколы были разработаны различными группами для поддержания таких образцов дрозофилы живыми и здоровыми для изучения поведения образца и флуоресцентных молекул в живых. Органы и ткани от мухи,такие как воображаемые диски 1,2,личинки мозга 3,4,5,6,илияйцеклеткивзрослых женщин 7, 8,9,иливзрослогокишечника 10, например, могут быть извлечены и хранятся в культуре для визуализации с замедленной микроскопии. Ключевой задачей для живой визуализации является обеспечение того, чтобы образец держался близко к поверхности изображения для оптимального разрешения и неподвижной без ущерба для целостности образца, который может быть чувствителен к механическим воздействиям. Для изучения нервных стволовых клеток, называемых нейробластов или нейронов в мозге личинки Drosophila, например, сохранение образцов близко к поверхности изображения может быть достигнуто путем покрытия их с культурой средств массовой информации в запечатанных камер изображения11,12,13. Однако такой подход не позволяет легко обмениваться средствами массовой информации, тем самым ограничивая экспериментальные возможности для маневра. Кроме того, образцы могут быть подготовлены и помещены на coverslips лечение для увеличения адгезии клеток и позволяют многоточенной посещения микроскопии и расширенной живой клетки изображения в открытых блюдах культуры, которые потенциально позволяют обмена средствами массовой информации, но не обеспечивают простые средства для предотвращения дрейфа образца или потериво время обмена средствами массовой информации 14,15.
Метод сгустка Фибрина, первоначально разработанный для изучения мейоза в живых сперматозоидахкрана-мухи 16, специально подходит для преодоления этих проблем. Фибриноген растворяется в соответствующей культурной среде, образцы помещаются и ориентируются в капле этого раствора на адекватной стеклянной поверхности камеры визуализации до добавления Тромбина, что приводит к быстрому образованию нерастворимого сгустка фибрина, липкой волокнистой сетки, которая прилипает к стеклянной поверхности и образцам, обеспечивая при этом доступ образца к культурной среде. Среда может быть обменялась, не возмущая сгусток или положение образца. Культурный средний обмен во время визуализации, например, желательно, когда ингибиторы должны быть добавлены, как в первоначальном методе или для мытья или импульса погони экспериментов или когда флуоресцентные красители должны быть добавлены во время живой визуализации клеток, сохраняя при этом клетки и ткани на месте. Фибрин сгустки подходят для визуализации тканей дрозофилы, а также отдельныхклеток 13,17. Fibrin сгустки могут быть использованы для оказания помощи восточных образцов, что из-за их формы или других свойств, как правило, не ориентированы в нужном направлении путем модуляции образца позиции в fibrin сгусток и форма самого сгустка.
Здесь мы предоставляем обновленную информацию о наших текущих fibrin сгустка на основе методов визуализации и предоставить инструменты для сегментации на основе анализа изображений и сосредоточиться на использовании этого метода для изучения нейробластов деления в развивающихся летать мозга. Мы регулярно используем метод сгустка Фибрина, чтобы следовать нескольким образцам в разных сгустках в одном и том же блюде культуры. Это позволяет i) изображение субклеточных событий, таких как центросомное поведение или локализациямРНК в прямом эфире 18,19, ii) мониторинг поведения образцов на фармакологическом лечении различных генотипов в тех же настройках изображения с использованием нескольких точка посещения микроскопии20, iii) изучение последствий острого ингибированияферментов 21 и iv) минимизации дрейфующих для изучения изменений в ориентации клеточного деления клеток в их физиологической среде на целевую лазерную абляцию22. В то время как нежелательные эффекты Тромбина и Фибриногена и сгустка Фибрина должны быть эмпирически протестированы для каждого образца, этот метод в принципе подходит для обездвиживания любого типаобразца,который должен быть проанализирован живой визуализации клеток и в Drosophila был успешно использован для изучения нескольких аспектов нейробластовбиологии 5,19,20, но и динамика цитозенсорных прогнозов женских зародышевой линиистволовых клеток 23 и изменения полярности при остром aPKC ингибирование фолликулных клеток drosophila женскихяйцеклеток 21.
Промежуток времени флуоресцентной визуализации приводит к генерации сложных временных 3D наборов данных, которые требуют методов для извлечения этой количественной информации. Здесь мы описываем наше дальнейшее развитие ImageJоснове 24 макросов, которые могут быть использованы для коррекции для дрейфующих в гиперстах и на заказ ImageJ макросов, которые позволяют полуавтоматической количественной многоканальной флуоресценции в клеточной коре разработаны для количественной коррекции корковых белков в нейробластов drosophila личинки мозга или отдельных нейробластов в первичной клеточной культуры.
Живое изображение всего крепления D. melanogaster личинки мозга дает возможность наблюдать асимметричные нейронные деления стволовых клеток в условиях, близких к физиологическому контексту. Первая часть нашего протокола вводит наш подход к вскрытию личинок мозга. Как ужеговорилось 13, важнейшим аспектом подготовки является, чтобы избежать повреждения мозга. Наиболее сложным аспектом этого является отделить мозг от соседних воображаемых дисков, не потянув чрезмерно на мозг. Наш подход к “резка без потянув” заключается в том, чтобы выполнить либо шлифовальные движения с кончиками одной пары типсов, или слайд типс советы по двум другим типса советы проведения связи между тканями (Рисунок 1A), в то время как Lerit и др. описать пилы, как движения с рассечением булавку. Мы советуем экспериментатору опробовать все подходы и принять наиболее подходящий для себя. Мы также предлагаем использовать BSA- или FCS покрытием пипетки советы, а не вскрытия инструментов для передачи изолированных мозгов. Покрытие предотвращает ткани от прилипания к пластику и позволяет безопасной передачи тканей, всегда сохраняя их полностью погружен, не подвергая их возможной преходящей деформации, как они прилипают к инструменту вскрытия во время передачи. Советы с покрытием имеют и другие преимущества, позволяющие передавать сразу несколько мозгов, что особенно полезно, когда крайне важно контролировать время проживания образцов в пределах конкретной среды; они подходят для переноса других тканей, даже хрупких, как, например, жировые тела; они могут вместить широкий спектр различных размеров выборки, используя большие советы или резки конечности кончика.
Далее, этот протокол описывает использование свертывания фибриногена для обездвиживания личинородного мозга на обложке культурного блюда. Мозг ориентирован в пределах капли среды культуры – фибриногена, после чего свертывание индуцируется добавлением Тромбина. Формирование Фибрина происходит постепенно, обеспечивая время, в течение которого ориентация образца может быть отлажена, при необходимости(рисунок 2C). Если требуется небольшое сжатие образца, против которого мы советуем в случае личинок мозга, его также можно точно отрегулировать, нажав на сгусток более или менее близко к образцу во время шагов 3.4.4 и 3.5.2. Основным преимуществом этой свертываемости фибриногена над протоколом, описанным в Lerit et al., в котором мозг устанавливается между проницаемой мембраной газа и крышкой, является способность заменить культурную среду во время живой визуализации. Возможным преимуществом использования газоназной мембраны над нашим протоколом может быть то, что она обеспечивает оптимальную оксигенацию образцов, которая может быть более ограничена с нашим подходом, поскольку мозг отделяется от воздуха сгустком и некоторыми средами. По этой причине, хотя мы не оценивали влияние количества среды культуры в культуре блюдо, мы предлагаем ограничить количество культуры среды на верхней части сгустков, сохраняя при этом сгустки полностью погружен.
Поскольку манипуляция тромбами может быть экспериментально трудной и трудоемкой, мы рекомендуем экспериментатору сначала поработать, манипулируя тромбами без образцов. Модуляция объема падения культуры среды и фибриногена на крышке, концентрация фибриногена или объем и концентрация тромбина может помочь сделать препарат проще и может быть важным при адаптации протокола к другим типам тканей. При достаточном опыте манипулирования сгустками, несколько мозгов могут быть обездвижены в один сгусток, если это необходимо, хотя это усложняет тонкой настройки ориентации. На крышке может образовываться несколько сгустков, что позволяет, например, образовывать образцы различных генотипов. Кроме того, можно подвергать различные сгустки на той же обложке для различных средств массовой информации культуры, хотя необходимо позаботиться никогда не смешивать капли культуры среды, охватывающих различные сгустки. После того, как личиножные мозги обездвижены и готовы к живой визуализации, мы советуем следовать рекомендациям Lerit et al.13, чтобы избежать чрезмерного фотосемья. Мы только добавляем к этим рекомендациям не только поддерживать мозг на 25 градусов по Цельсию во время живой визуализации со сценическим инкубатором, но и разогреть этот этап, по крайней мере за 30 минут до начала визуализации. В наших руках, неспособность сделать это систематически приводит к сильному дрейфу фокусировки.
Это может быть выгодно в некоторых контекстах, чтобы иметь возможность выполнять коррелированную микроскопию и исправить и определить иммунитет образца после живой визуализации. Тем не менее, ограничение использования сгустков Фибрина является то, что это почти невозможно механически изолировать мозг от сгустка, не повреждая его. Возможный способ преодолеть это ограничение может быть разработка методов для деградации сгустков Фибрина с плазмином или вызвать разборку сгустка путем добавления пептида, имитирующий ручки, позволяющие полимеризации Фибрина28. Обычно мы используем сгустки Фибрина на образцах от одиночных клеток до 200 мкм длинных тканей, но мы также можем успешно обездвижить сгустки и мозг изображения взрослых шмелей шириной более 3 мм. Верхний предел размера выборки, который может быть обездвижен тромбами, еще предстоит определить. Аналогичным образом, хотя мы обычно изображение иммобилизованных образцов для 4 до 5 ч, мы успешно изображения нейробластов в первичной культуре на срок до 3 дней, что свидетельствует о том, что сгусток по крайней мере не мешает долгосрочной жизнеспособности. Напротив, сгустки могут способствовать регулярной замене среды, требование для долгосрочной визуализации, без необходимости устройств, таких как перистатические насосы для этой цели. Хотя мы не измерили параметры проницаемости сгустков фибрина, волокнистый гель-как характер сгустков, как представляется, проницаемые клеток проницаемых молекул. Мы обнаружили, что Latrunculin A, Colcemid или 1-NAPP1, HALO-тег лиганды и другие стандартные красители, используемые в клеточной биологии достичь клеток в фибриновом сгустке без каких-либо проблем и до сих пор не сталкиваются молекулы, которые будут сохранены сгустка, который, однако, является возможность, которая должна быть эмпирически протестирована.
В заключение, использование сгустков Фибрина обеспечивает надежный и относительно простой в реализации способ иммобилизации живых тканей для живой визуализации. Помимо своей полезности в ограничении бокового дрейфующих, способность изменять культуру среды во время живой визуализации оказался бесценным для нашей химической генетики подход к изучению асимметричного деления клеток D. melanogaster neuroblasts21. Мы ожидаем, что этот метод будет полезен для исследований в широком диапазоне различных тканей, особенно если они связаны с химической генетикой или, например, белкасамонаклеивания 29.
Наш макрос MultiHyperStackReg опирается на плагин TurboReg ImageJ, который выравнивает последовательные кадры или фрагменты стека, и плагин MultiStackReg ImageJ, который позволяет применять преобразования к другим стекам. MultiHyperStackReg просто позволяет применять эти преобразования к гиперстах (стеки, по крайней мере, с четырьмя измерениями). Поскольку использование MultiHyperStackReg, как мы его описываем, требует много действий и может получить довольно много времени, мы также написали autoHyperStackReg макрос, который автоматически выполняет все шаги, описанные в шагах 6.2 и 6.3. Однако, в отличие от MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg в настоящее время не имеет возможности рассчитать выравнивание стека на основе субрегиона этого стека, вариант, который мы обнаружили, иногда имеет решающее значение для удовлетворяющих выравнивания. Еще одним ограничением AutoHyperStackReg является то, что его использование ограничено переводами, а не другими преобразованиями, предложенными TurboReg и MultiStackReg, в то время как MultiHyperStackReg может применяться к гиперстаку любого типа преобразования, если он нужен пользователю. Будущие релизы будут реализовывать эти функции и будут доступны на GitHub30. Наконец, наш вращающийся макрос linescan обеспечивает простой способ быстро измерить корковые сигналы во временных промежутках, даже если кора изменяет свое положение или ориентацию с течением времени. Подходит ли его режим отслеживания или режим не отслеживания для анализа, зависит от качества и согласованности коркового сигнала. Режим отслеживания проще в использовании, так как пользователю не нужно учитывать, где кора будет для каждой точки времени и может вместить большие изменения положения и ориентации с течением времени. Однако он подходит только в том случае, если корковый сигнал остается достаточно сильным для обнаружения в течение всего фильма: неспособность обнаружить что-либо еще, кроме коры (например, яркий цитоплазмический отсек близко к коре головного мозга) может поставить под угрозу обнаружение для каждого следующего промежутка времени (например, цитоплазмический отсек отходит от коры и корковых линий следует за ним до конца промежутка времени). Режим не отслеживания не имеет этой ловушки, так как обнаружение ограничено линией, первоначально нарисованной пользователем (например, яркий цитоплазмический отсек может привести к тому, что обнаружение потерпит неудачу в течение нескольких точек времени, но по мере того, как цитоплазмический отсек отходит от зоны обнаружения, правильное обнаружение коры возобновляется), но не ведет себя хорошо, если положение коры или ориентация значительно меняется с течением времени. Следующей функцией (которая будет доступна на GitHub30), которая будет разработана для режима отслеживания будет возможность анализировать только указанные точки времени и определить точку отсчета (а не первую точку времени), перед которой и после чего будет выполнено обнаружение, что позволит пользователю по крайней мере избежать проблемных точек времени.
The authors have nothing to disclose.
Работа в лаборатории Янушке поддерживается грантами Wellcome Trust 100031/Q/12/A и 1000032/q/12/A. Оборудование для визуализации тканей поддерживается грантом WT101468 от Wellcome.
Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |