Мы представляем метод, специально разработанный для изображения всего мозга взрослого Drosophila во время поведения и в ответ на раздражители. Голова расположена, чтобы обеспечить оптический доступ ко всему мозгу, в то время как муха может двигать ногами и антеннами, кончиком хоботка, и глаза могут получать сенсорные стимулы.
Мы представляем метод, разработанный специально для изображения всего мозга Дрозофилы во время текущего поведения, такого как ходьба. Фиксация головы и вскрытие оптимизированы, чтобы свести к минимуму их влияние на поведение. Это сначала достигается с помощью держателя, который сводит к минимуму препятствия движения. Задняя часть головы мухи приклеена к этому держателю под углом, который позволяет оптический доступ ко всему мозгу, сохраняя при этом способность мухи ходить, ухаживать, пахнуть, вкус и видеть. Задняя часть головы вскрывается для удаления тканей в оптическом пути и мышц, ответственных за движения головы артефактов. Мозг мухи впоследствии может быть изображен для записи активности мозга, например, с использованием кальция или индикаторов напряжения, во время конкретных видов поведения, таких как ходьба или уход, и в ответ на различные стимулы. После того, как сложные вскрытия, которая требует значительной практики, была освоено, этот метод позволяет записывать богатые наборы данных, связанные всей деятельности мозга поведения и стимулов ответов.
Воображение мозговой активности с использованием различных методов углубило понимание функции мозга. У людей методы визуализации мозга имеют важные ограничения: в то время как функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ) предлагает пространственно-временное разрешение намного ниже разрешения одного нейрона, быстрые методы, такие как электроэнцефалография (ЭЭГ), позволяют только косвенный и частичный доступ кмозгу 1. В достаточно крупных животных моделях, таких как грызуны, запись датчиков флуоресцентной активности (например, GCaMP) с помощью головы установленных микроскопов позволяет наблюдать активность мозга в то время как животное движется всвоей среде 2. Тем не менее, эти методы в настоящее время дают доступ только к небольшой части мозга. Головные животные могут быть изображены более полно, но покрытие по-прежнему частично (например, поверхность коры3). Только у мелких животных, таких как личинки зебры, C. elegans и Drosophila, что весь мозг может быть изображен с временным и пространственным разрешением на уровне или близко к одномунейронов 4.
D. melanogaster является особенно перспективным, поскольку он уже давно используется в качестве генетическоймодели организма 5 и мощные генетические инструменты были разработаны6. Дополненная новой крупномасштабной анатомической сетью, полученной из электронноймикроскопии 7, муха можетпредоставить уникальные возможности для изучения сложной динамики мозга, генерируемой вкрупномасштабной сети 8. Хотя кутикула не является прозрачной, и, таким образом, должны быть удалены для изображения мозга, in vivo функциональной визуализации становится все более и более распространенным местом с момента первого исследования в 2002году 9 и несколько протоколов уже были опубликованы. Тем не менее, эти методы включают либо отделение головы мухиот тела 10, серьезно ограничивая движения мухи и / или ответы нараздражители 11,12,13,14,15, или только разрешение небольшой части мозга, чтобы бытьизображены 9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. В дополнение к этим, тем не менее, мощные подходы, мы недавно разработали подготовку к изображению всего мозга во время поведения и ответы на различныестимулы 28.
Здесь мы опираемся на это исследование, чтобы представить метод, специально разработанный для изображения всего мозга в то время как муха выполняет полу-натуралистическое поведение (т.е. ходьба и уход) и реагирует на сенсорные стимулы. Это достигается с помощью держателя наблюдения, предназначенного для обеспечения доступа ко всему мозгу с спинно-задней стороны, оставляя антенны и хоботок нетронутыми, и позволяя мухе двигать ногами, чтобы ходить (например, на воздушном шаре). Шаги для вскрытия задней части головы были уточнены для скорости, воспроизводимости, и свести к минимуму их влияние на жизнеспособность и мобильность мухи.
Дрозофила является одним из редких взрослых животных, где весь мозг может быть изображен во время сложного поведения. Здесь мы представляем метод подготовки мухи и подвергать весь ее мозг изображению текущей всей деятельности мозга. Следует отметить несколько важных моментов.
Вскрытие небольшого животного, такого как D. melanogaster является сложной задачей. Таким образом, метод требует много практики и терпения, чтобы освоить его. Однако после тренировки процедура занимает менее 30 минут и дает воспроизводимые результаты.
Метод, который мы представили, имеет дополнительные ограничения. Во-первых, наклон головы мухи из ее естественного положения приводит к растяжению шеи, которые могут повредить соединительной ткани, нервов или мышц. Во-вторых, хотя вентраловая подэзофагеальная зона (СЕЗ) оптически доступна, она находится ниже полупрозрачного пищевода, что снижает интенсивность и разрешение в этой области. Наконец, хотя держатель находится вне досягаемости в большинстве направлений, муха все еще иногда осознает свое присутствие и толкает на него, чтобы попытаться бежать.
Несмотря на эти ограничения, всеобъемлющие данные, полученные от всего изображения мозга во время поведения и реакции на раздражители позволит расшифровать функции мозга на уровне всей сети, когда животное взаимодействует с и перемещается сложных, натуралистических средах.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Хайди Миллер-Mommerskamp за техническую помощь и Ивет Мелисса Guatibonza Arevalo за полезные комментарии по рукописи. Первоначальные версии протокола были разработаны в лаборатории Ральфа Гринспена. Эта работа была поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG), в частности, через грант FOR2705 (TP3) для IGK, и Фонд Симонс (Aimon – 414701) и Кавли Институт мозга и разума (грант номер #2017-954), полученный SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |