Automatisert ganganalyse er et mulig verktøy for å evaluere funksjonell gjenoppretting i gnagermodeller av perifer nerveskade og ryggmargskontusjonsskade. Selv om det bare krever ett oppsett for å vurdere lokomotorisk funksjon i ulike eksperimentelle modeller, er omhyggelig hard- og soft-ware justering og trening av dyrene svært viktig.
Perifere og sentrale nerveskader studeres for det meste hos gnagere, spesielt rotter, gitt det faktum at disse dyremodellene er både kostnadseffektive og mange komparative data har blitt publisert i litteraturen. Dette inkluderer en rekke vurderingsmetoder for å studere funksjonell gjenoppretting etter nerveskade og reparasjon. Foruten evaluering av nerveregenerering ved hjelp av histologi, elektrofysiologi og andre in vivo- og in vitro-vurderingsteknikker, er funksjonell gjenoppretting det viktigste kriteriet for å bestemme graden av nevrale regenerering. Automatisert ganganalyse tillater registrering av en stor mengde gangartrelaterte parametere som Paw Print Area og Paw Swing Speed, samt tiltak for inter-lem koordinering. I tillegg gir metoden digitale data om rottenes poter etter nevronal skade og under nerveregenerering, og legger til vår forståelse av hvordan perifere og sentralnerveskader påvirker deres lokomotoriske oppførsel. Foruten den overveiende brukte isjiasnerveskademodellen, kan andre modeller av perifer nerveskade som lårnerven studeres ved hjelp av denne metoden. I tillegg til skader i perifere nervesystemer, kan lesjoner i sentralnervesystemet, for eksempel ryggmargskontusjon, evalueres. Gyldig og reproduserbar datavurdering er sterkt avhengig av omhyggelig justering av innstillingene for hardt og programvare før datainnhenting. I tillegg er riktig opplæring av de eksperimentelle dyrene av avgjørende betydning. Dette arbeidet tar sikte på å illustrere bruken av datastyrt automatisert ganganalyse for å vurdere funksjonell utvinning i ulike dyremodeller av perifer nerveskade samt ryggmargskontusjonsskade. Det understreker også metodens begrensninger, for eksempel evaluering av nerveregenerering hos rotter med isjiasnervevektose på grunn av begrenset funksjonell gjenoppretting. Derfor er denne protokollen antatt å hjelpe forskere som er interessert i perifere og sentralnerveskader for å vurdere funksjonell gjenoppretting i gnagermodeller.
Skader på perifert og sentralnervesystemet studeres ofte hos gnagere, noe som resulterer i en stor mengde komparative data om løpet av nerveskade, reparasjon eller nevrobeskyttelse for å motvirke ytterligere sekundære skader og regenerering1,2,3. Utfallet av eksperimentelle behandlingsstrategier i gnagermodeller kan vurderes ved en rekke teknikker som histologi, immunohistokjemi, elektrofysiologi og bildeteknikker som røntgenmikrotomografi (μCT), men det viktigste kriteriet for å bestemme suksessen til en behandling er – som hos menneskelige pasienter – graden av funksjonellgjenoppretting 4,5. De første studiene som undersøker lokomotorisk ytelse hos gnagere dateres tilbake til 1940-tallet6,7,8. Rotter og mus ble utsatt for en stor mengde studier som undersøkte deres lokomotoriske oppførsel i de følgendetiårene 9,10,11. I dag finnes det et bredt spekter av vurderingsteknikker for gnagermodeller av perifere og sentrale nerveskader, alt fra gangsporanalyse med blekk og papir12,13,14 over ankel- og gangart kinematikk15,16,17 til maskinlæring forbedrede metoder, noe som gir mulighet for kompleks estimering av gangart, lem og felles baner18,19.
Datastyrt automatisert ganganalyse (AGA) brukes til å evaluere lokomotorisk funksjon etter perifere og sentralnerveskader og potensiell eksperimentell behandling av slike skader. Enheten består hovedsakelig av en glassgangvei og en lyskilde som lyser gnagerens poteutskrifter i korrelasjon med trykket som overskrides av dem. Disse dataene datastyres deretter for å beregne et bredt utvalg av statiske og dynamiske parametere. Ifølge Deumens kan disse parametrene videre deles inn i kategoriene generelle parametere, smerterelaterte parametere samt koordineringsrelaterte parametere forgangart 20 (tabell 1). Muligheten for AGA for å oppdage endringer i gangart atferd har blitt bevist i ulike dyremodeller av perifer nerveskade (PNI)21, for eksempel isjiasnerven20,lårnerven22, og median nerve23,24. Det brukes også rutinemessig til å vurdere lokomotorisk funksjon hos rotter med sentralnerveskader, for eksempelslag 25 eller ryggmargskontusjon26. Metodens fremskritt ligger i den store mengden sammenlignbare data og dens mulighet til å registrere en mengde parametere knyttet til gangart27. Dette papiret tar sikte på å gi forskere som er interessert i dyremodeller av PNI og ryggmargsskade (SCI) en detaljert og praktisk retningslinje for å vurdere lokomotorisk funksjon i slike modeller.
Kategori | Parameteren | Beskrivelse | |
Generelle parametere for gangart | Utskriftsområde (avstandsenhet) | Område av pote utskrift | |
Utskriftslengde (avstandsenhet) | Lengden på poteutskriften | ||
Støttebase (BoS) (avstandsenhet) | Avstand mellom de to bak- eller fremre potene | ||
Løpelengde (avstandsenhet) | Avstand mellom to påfølgende plasseringer av en pote | ||
Smerterelaterte parametere for gangart | Svingtid (er) | Varighet av svingfasen | |
Ståtid (er) | Varighet av holdningsfasen | ||
Gjennomsnittlig poteutskriftsintensitet (vilkårlig enhet) | Gjennomsnittlig iIntensity av poten print i løpet av holdningsfasen | ||
Koordineringsrelaterte parametere for gangart | Normale trinn sekvens mønstre (NSSP) | Spesifikke sekvenser av poteplasseringer under en trinnsyklus | |
Fase dispersjoner (%) | Timelige forskjeller mellom trinnsyklusene til to spesifikke poter | ||
Regularitetsindeks (RI) (%) | Kvantifisering av interlimb koordinering ved å dele mengden feilfri NSSP ganger 4 med det totale antallet poteplassering i løpet av ett trinn syklus |
Tabell 1: Parametere for gangart som kan vurderes med den automatiserte ganganalysen. Kategoriene der parametrene er klassifisert er valgt i henhold til Deumens et al.20.
Vurdering av funksjonell utvinning i dyremodeller av PNI og SCI er fortsatt utfordrende på grunn av det store utvalget av evalueringsmetoder, hver med individuelle fordeler og ulemper. Bare få tilnærminger har blitt testet og validert i flere modeller av perifere og sentralnerveskader, selv om lovende nye teknikker som kombinerer bevegelsessporing og maskinlæring kan potensielt drive nevroatferdsforskning til neste nivå av funksjonell testing. Vi er overbevist om at banebrytende metoder som er bredt anvendelige for et bredt utvalg av dyre- og skademodeller snart vil dukke opp. I lys av disse betraktningene er en av fordelene med AGA muligheten til å evaluere funksjonell gjenoppretting i flere modeller av nerveskade ved hjelp av bare én enhet. Siden tidlig på 2000-tallet har denne tilnærmingen blitt brukt i eksperimentelle modeller av PNI somisjias 37,peroneal38og lårnerveskade modell22, samt etter rot avulsion av både lumbal39 og brachial plexus40. Ulike sentralnerveskader, inkludert ryggmargskontusjonsskade, er også studert med metoden41,42. Med dette papiret presenterte vi en detaljert protokoll om hvordan man induserer tre vanlige nerveskader, samt hvordan man evaluerer funksjonell gjenoppretting etterpå. Etter vår mening ville en praktisk retningslinje for forskere som er interessert i området eksperimentell nerveskade, reparasjon og regenerering om hvordan man kan gjøre optimal bruk av metodens fordelaktige egenskaper være til stor hjelp.
Flere forfattere har adressert potensialet til AGA for å evaluere funksjonell gjenoppretting hos gnagere, og fremhever metodens fordel for å samtidig vurdere gangartparametere knyttet til motor og sensorisk reinnervation27,28. I tillegg, sammenligning av data fra en eksperimentell pote, for eksempel rekonstruert nerveskade til en ikke-bruket pote som det ble vist i begge modellene som presenteres tillater inkludering av en intra-dyr positiv kontroll. Omvendt kan en operert pote uten kirurgisk rekonstruksjon eller ytterligere behandling tjene som en intra-dyr negativ kontroll. Det ble også vist at det er mulig å kombinere AGA med maskinlæring tilnærminger43. Til tross for metodens fordeler, har den også flere begrensninger og ulemper, for eksempel den tidkrevende treningsinnsatsen, som er obligatorisk for å venne dyret til oppkjøpsprosedyren28,44. En annen begrensning av AGA er den maksimale størrelsen på dyrene som er kvalifisert for testing på grunn av apparatets begrensede dimensjoner. Derfor er bruken av AGA for tiden begrenset til dyr på størrelse med gnagere og ildere45. I tillegg kan nylig nye nevroatferdsvurderingsmetoder innen bevegelsessporing som er i stand til maskinlæring, overgå AGA i både omfattende så vel som mulige applikasjoner18,19,46. Mest bemerkelsesverdig, men i samsvar med andre evalueringsmetoder, ser det ut til at funksjonell utvinning som vurdert av AGA er sterkt begrenset – hvis selv forekommer- i modeller av isjiasnerveovitenskap47,48. På den annen side gir AGA omfattende evaluering av løpet av funksjonell gjenoppretting etter lårnerve nevrotmese som vist av våre data. Med dette arbeidet demonstrerte vi at Paw Print Area er en representativ gangartparameter som kan vurderes via AGA, noe som er eksemplarisk for løpet av funksjonell gjenoppretting i de to nevnte perifere nerveskademodellene presentert av oss. Mens funksjonell utvinning annonse integrum var observerbar etter autograft reparasjon av lårnerven, AGA parametere ble fortsatt betydelig endret fra baseline på slutten av observasjonsperioden etter autograft reparasjon av isjiasnerven. Det er bemerkelsesverdig i denne sammenheng at lem kontrakturer er et vanlig fenomen hos rotter med isjiasnerveskade og forsiktighet er nødvendig for ikke å forvirre disse tegn på muskelubalanse og lammelse med den fortsatte funksjonelleutvinningen 32. Dette på den ene siden understreker AGA-metodens manglende evne til å oppdage betydelig funksjonell gjenoppretting etter nevrotmeseskade i denne modellen. På den annen side reiser det spørsmålet om det er mulig å evaluere den isjiasnerveskademodellen til rotten, som fortsatt er den mest brukte eksperimentelle nervereparasjonsmodellen, ved hjelp av ganganalyse generelt i tilfelle nerveskaden er mer alvorlig enn axonotmesis48. Du finner feilsøkingsdetaljer i Tilleggsfilen 1.
Vi har også gitt eksemplariske data om bruk av metoden for å evaluere lokomotorisk funksjon hos rotter med ryggmargsskade, noe som er mulig uten nødvendige endringer i maskinvareoppsettet eller oppkjøpsprosedyren. Det samme prinsippet gjelder for andre gnagermodeller av sentralnerveskade (CNI)26,49,50 og rotavulsjonsskade. I motsetning til isolerte PNIer er skader i ryggmargen langt mer komplekse i deres patofysilogiske konsekvenser, da en rekke svært viktige strukturer er skadet, som involverer efferent veier som kortikospinal- og rubrospinale traktater og afferent veier som ryggsøyler og spinothalamus traktater35. Utfordringen med å tilstrekkelig vurdere disse patologiske endringene gjenspeiles i den omfattende bevæpningen av atferdstester, som Basso, Beattie og Bresnahan (BBB) score36. Gangart parameteren Base of Support har blitt rapportert å øke etter sentralnerveskader, mest sannsynlig for å gjøre rede for en resulterende instable gangart. Base of Support ble betydelig endret fra baseline fra WPO10 til WPO14 i vår modell, og støtter vår antagelse om at denne parameteren tillater vurdering av løpet av funksjonell gjenoppretting av AGA etter thorax ryggmargskontusjonsskade.
Vi er overbevist om at AGA er et mulig verktøy for å evaluere funksjonell gjenoppretting hos gnagere med skader i nervesystemet. Likevel anbefaler vi å reflektere de observerte endringene av gangart nøye og grundig i hvert respektive eksperimentelle oppsett. Endringer i gangartparametere, for eksempel en økning i utskriftsområdet etter en umiddelbar postoperativ reduksjon eller en reduksjon i Swing Time som foregår en umiddelbar postoperativ økning av denne parameteren, i løpet av observasjonsperioden, er ikke uunngåelig relatert til funksjonell gjenoppretting. I stedet kan disse endringene også være relatert til en mulig funksjonell tilpasning for å opprettholde en ubetydelig gangart, gitt at rotter er en byttedyrart og prøver å unngå å vise smerte eller funksjonshemning tilpotensielle rovdyr 51. Det anbefales derfor å bruke automatisert ganganalyse som et komplementært verktøy for å relatere endringer av gangart til andre utfallsmål for perifer nerveskade og regenerering21. Som nevnt tidligere, mener vi også at det bør gjenspeiles nøye hvis gnagere med isjiasnerveotmesis bør undersøkes ved hjelp av AGA, da vårt funn sterkt indikerer at funksjonell gjenoppretting er sterkt begrenset i dette tilfellet.
Som vist i vårt arbeid, er AGAs viktigste ressurs muligheten til å studere både motorisk og sensorisk reinnervasjon i en rekke eksperimentelle PNI-modeller samt CNI, samtidig som det bare krever ett oppsett. Derfor er metoden etter vår mening et svært verdifullt verktøy for omfattende nevroatferdstesting. En av AGAs eiendeler, som er muligheten til å studere motoriske og sensoriske reinnervation i ulike dyremodeller av PNI og CNI mens det bare krever ett oppsett, er etter vår mening metodens største fordel i forhold til andre evalueringsmetoder for å studere funksjonell utvinning, for eksempel gangsporanalyse52, Von Frey testing53eller gangart kinematikk16. Potensialet til samtidig å evaluere endringer av gangart som enten korrelerer med resultatene av elektrofysiologiske undersøkelser av reinnervated muskel22 eller evalueringsmetoder for sensoriskfunksjon 54 er lovende med hensyn til fremtidige anvendelser av metoden. Vi anbefaler derfor å bruke AGA til å undersøke funksjonell gjenoppretting i gnagermodeller av forben PNI, for eksempel ulnar, radial eller median nerve, eller eksperimentelle nerveoverføringsmodeller55, som forblir ustudert med denne metoden ennå.
Vi gir herved en detaljert protokoll om hvordan du bruker automatisert ganganalyse for å studere funksjonell gjenoppretting i tre gnagermodeller av nerveskade. Mens metoden krever nøye vurdering av ulike viktige aspekter som tilstrekkelig trening og omhyggelig hard- og programvarekalibrering, er det et mulig og verdifullt komplementært verktøy for å evaluere nerveregenerering i gnagermodeller av sentral og perifer nerveskade.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Karin Brenner for hennes lidenskapelige omsorg for dyrene. Forfatterne vil også takke Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner og Susanne Drechsler for deres hjelp under eksperimentelle operasjoner.
0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat () | Janvier | N/A | Experimental animal |
Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
Sprague Dawley rat () | Janvier | N/A | Experimental animal |
Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |