Automatiseret gangart analyse er et muligt værktøj til at evaluere funktionelle opsving i gnaver modeller af perifere nerveskade og rygmarvskontusion skade. Selv om det kun kræver én opsætning at vurdere bevægelsesfunktion i forskellige eksperimentelle modeller, er omhyggelig justering og træning af dyrene meget vigtigt.
Perifere og centrale nerveskader er for det meste undersøgt hos gnavere, især rotter, da disse dyremodeller er både omkostningseffektive og en masse sammenlignende data er blevet offentliggjort i litteraturen. Dette omfatter en lang række vurderingsmetoder til undersøgelse af funktionel helbredelse efter nerveskade og reparation. Udover evaluering af nerve regenerering ved hjælp af histologi, elektrofysiologi, og andre in vivo og in vitro vurdering teknikker, funktionelgenopretning er det vigtigste kriterium for at bestemme graden af neurale regenerering. Automatiseret gangart analyse giver mulighed for registrering af en enorm mængde af gangart-relaterede parametre såsom Paw Print Area og Paw Swing Speed samt mål for inter-lemmer koordinering. Derudover, metoden giver digitale data om rotternes poter efter neuronal skade og under nerve regenerering, hvilket bidrager til vores forståelse af, hvordan perifere og centrale nervøse skader påvirker deres bevægelsesadfærd. Udover den overvejende anvendte iskiasnerven skade model, andre modeller af perifere nerveskade såsom lårbensnerven kan studeres ved hjælp af denne metode. Ud over skader i det perifere nervesystem, læsioner i centralnervesystemet, f.eks rygmarvskontusion kan evalueres. Gyldig og reproducerbar datavurdering er stærkt afhængig af omhyggelig justering af de hårde og softwareindstillinger forud for dataindsamling. Desuden er korrekt uddannelse af forsøgsdyr af afgørende betydning. Dette arbejde har til formål at illustrere brugen af edb automatiseret gangart analyse til at vurdere funktionelle opsving i forskellige dyremodeller af perifere nerveskade samt rygmarvskontusion skade. Det understreger også metodens begrænsninger, fx evaluering af nerve regenerering hos rotter med iskiasnerven neurotmesis på grund af begrænset funktionel opsving. Derfor, denne protokol menes at hjælpe forskere interesseret i perifere og centralnerveskader til at vurdere funktionelle opsving i gnaver modeller.
Skader i det perifere og centrale nervesystem er ofte undersøgt i gnavere, hvilket resulterer i en stor mængde af sammenlignelige data om løbet af nerveskader, reparation, eller neuroprotection at modvirke yderligere sekundære skader og regenerering1,2,3. Resultatet af eksperimentelle behandlingsstrategier i gnavere modeller kan vurderes ved en række teknikker såsom histologi, immunhistrokemi, elektrofysiologi, og billeddannelse teknikker såsom X-ray mikrotomografi (μCT) scanninger, men det vigtigste kriterium for at bestemme succes en behandling er-ligesom hos menneskelige patienter-graden af funktionel opsving4,5. De første undersøgelser af bevægelsesfremmende resultater hos gnavere går tilbage til 1940’erne6,7,8. Rotter og mus var genstand for en stor mængde undersøgelser undersøge deres bevægelsesadfærd i de følgende årtier9,10,11. I dag findes der en bred vifte af vurderingsteknikker for gnavermodeller af perifere og centrale nerveskader, lige fra analyse af vandrespor med blæk og papir12,13,14 over ankel- og gangteknikkinematik15,16,17 til machine-learning forbedrede metoder, som giver mulighed for kompleks estimering af gangart, lemmer og fælles baner18,19.
Edb Automated Gait Analysis (AGA) bruges til at evaluere bevægelsesfunktion efter perifere og centrale nervøse skader og potentielle eksperimentelle behandling af sådanne skader. Enheden består hovedsageligt af en glasgangbro og en lyskilde, der oplyser gnaverens pote prints i sammenhæng med trykket overskrides af dem. Disse data er derefter edb til at beregne en bred vifte af statiske og dynamiske parametre. Ifølge Deumens kan disse parametre yderligere opdeles i kategorierne generelle parametre, smerterelaterede parametre samt koordineringsrelaterede parametre for gangart20 (tabel 1). Gennemførligheden af AGA at opdage ændringer i gangart adfærd er blevet bevist i forskellige dyremodeller af perifere nerveskade (PNI)21, såsom iskiasnerven20,lårbensnerven22, og median nerve23,24. Det er også rutinemæssigt anvendes til at vurdere bevægelsesfunktion hos rotter med centralnerveskader, f.eks slagtilfælde25 eller rygmarvskontusion26. Metodens fremskridt ligger i den store mængde sammenlignelige data og dens mulighed for at registrere et væld af parametre relateret til gangart27. Dette papir har til formål at give forskere interesseret i dyremodeller af PNI og rygmarvsskader (SCI) med en detaljeret og hands-on retningslinje til at vurdere bevægelsesfunktion i sådanne modeller.
Kategori | Parameter | Beskrivelse | |
Generelle parametre for gangart | Udskriftsområde (afstandsenhed) | Område af pote print | |
Udskriftslængde (afstandsenhed) | Længden af pote print | ||
Base of Support (BoS) (afstandsenhed) | Afstand mellem de to bag- eller forpoter | ||
Skridtlængde (afstandsenhed) | Afstand mellem to på hinanden følgende placeringer af en pote | ||
Smerterelaterede parametre for gangart | Svingtid (er) | Swingfasens varighed | |
Stand time (er) | Varighed af holdningsfasen | ||
Gennemsnitlig paw printintensitet (vilkårlig enhed) | Gennemsnitlig iIntensitet af pote print under holdning fase | ||
Koordineringsrelaterede parametre for gangart | Normale trinsekvensmønstre (NSSP) | Specifikke sekvenser af poteplaceringer under en trincyklus | |
Fase dispersioner (%) | Tidsmæssige forskelle mellem trincyklusserne for to specifikke poter | ||
Regularity Index (RI) (%) | Kvantificering af interlimb koordination ved at dividere mængden af fejlfri NSSP gange 4 med det samlede antal pote placering i løbet af et trin cyklus |
Tabel 1: Parametre for gangart, der kan vurderes med den automatiserede ganganalyse. De kategorier , som parametrene klassificeres i , vælges i henhold til Deumens et al.20.
Vurderingen af funktionel nyttiggørelse i dyremodeller af PNI og SCI er fortsat udfordrende på grund af de mange forskellige evalueringsmetoder, hver med individuelle fordele og ulemper. Kun få tilgange er blevet testet og valideret i flere modeller af perifere og centrale nervøse skader, selv om lovende nye teknikker, der kombinerer motion tracking og machine learning potentielt kunne drive neurobehavioral forskning til det næste niveau af funktionelle test. Vi er overbevist om, at avancerede metoder, der i vid udstrækning kan anvendes på en lang række dyre- og skadesmodeller, snart vil dukke op. I lyset af disse overvejelser, en af fordelene ved AGA er muligheden for at evaluere funktionelle opsving i flere modeller af nerveskade ved hjælp af kun én enhed. Siden begyndelsen af 2000’erne denne fremgangsmåde har været anvendt i eksperimentelle modeller af PNI såsom iskias37, peroneal38, og femoralnerverskade model22 samt efter rod avulsion af både lændebenet39 og brachial plexus40. Forskellige centralnerveskader, herunder rygmarvskontusionsskader, er også blevet undersøgt med metoden41,42. Med dette papir, præsenterede vi en detaljeret protokol om, hvordan man fremkalder tre almindeligt studerede nerveskader samt hvordan man kan evaluere funktionelle opsving bagefter. Efter vores mening, en hands-on-retningslinje for forskere interesseret i området for eksperimentelle nerveskade, reparation, og regenerering om, hvordan man kan gøre optimal brug af metodens fordelagtige funktioner ville være til stor hjælp.
Flere forfattere har behandlet potentialet i AGA til at evaluere funktionelle opsving i gnavere, fremhæver metodens fordel til samtidig at vurdere gangart parametre relateret til motoriske og sensoriske reinnervation27,28. Derudover giver sammenligning af data fra en eksperimentel pote, fx rekonstrueret nerveskade til en ikke-operativ pote, som det blev vist i begge de præsenterede modeller, mulighed for at inkludere en intradyret positiv kontrol. Omvendt, en opereret pote uden kirurgisk rekonstruktion eller yderligere behandling kan tjene som en intra-dyr negativ kontrol. Det blev også påvist, at det er muligt at kombinere AGA med machine learning tilgange43. På trods af metodens fordele har den også flere begrænsninger og ulemper, såsom den tidskrævende uddannelsesindsats, som er obligatorisk for at vænne dyret til anskaffelsesproceduren28,44. En anden begrænsning af AGA er den maksimale størrelse af de dyr, der kan testes på grund af apparatets begrænsede dimensioner. Anvendelsen af AGA er derfor i øjeblikket begrænset til dyr på størrelse med gnavere og fritter45. Derudover kan nyligt fremspirende neurobehavioral vurdering tilgange inden for motion tracking i stand til machine-learning overgår AGA i både comprehensiveness samt mulige applikationer18,19,46. Mest bemærkelsesværdige, men i overensstemmelse med andre evalueringsmetoder, ser det ud til, at funktionelle opsving som vurderet af AGA er stærkt begrænset, hvis selv forekommende-i modeller af iskiasnerven neurotmesis47,48. På den anden side, AGA giver mulighed for omfattende evaluering af løbet af funktionelle opsving efter femorale nerve neurotmesis som vist ved vores data. Med dette arbejde, viste vi, at Paw Print Area er en repræsentativ gangart parameter vurderes via AGA, som er eksemplarisk for løbet af funktionelle opsving i de to førnævnte perifere nerveskade modeller præsenteret af os. Mens funktionelle opsving ad integrum var observerbare efter autograft reparation af lårbensnerven, AGA parametre blev stadig væsentligt ændret fra baseline i slutningen af observationsperioden efter autograft reparation af iskiasnerven. Det er bemærkelsesværdigt i denne sammenhæng, at lemmer kontrakturer er et almindeligt fænomen hos rotter med iskiasnerven skade og forsigtighed er nødvendig for ikke at forveksle disse tegn på muskuløs ubalance og lammelse med proceduren funktionelle opsving32. Dette på den ene side understreger AGA-metodens manglende evne til at opdage signifikant funktionel genopretning efter neurotmesis skade i denne model. På den anden side, Det rejser spørgsmålet om, hvorvidt det er muligt at vurdere iskiasnerven skade model af rotten, som stadig er den mest almindeligt anvendte eksperimentelle nerve reparation model, ved hjælp af gangart analyse i almindelighed i tilfælde af nerveskade er mere alvorlig end axonotmesis48. Oplysninger om fejlfinding findes i supplerende fil 1.
Vi har også givet eksemplariske data om brugen af metoden til at evaluere bevægelsesfunktion hos rotter med rygmarvsskade, hvilket er muligt uden de nødvendige ændringer af hardwareopsætningen eller anskaffelsesproceduren. Det samme princip gælder for andre gnavere modeller af centralnerveskade (CNI)26,49,50 og root avulsion skade. I modsætning til isolerede PNIs, skader på rygmarven er langt mere komplekse i deres patofysiologiske konsekvenser, som en lang række meget vigtige strukturer er beskadiget, involverer efferent veje såsom kortikospinal og rubrospinal skrifter og afferent veje såsom dorsale kolonner og spinotalamic skrifter35. Udfordringen med at foretage en tilstrækkelig vurdering af disse patologiske ændringer afspejles i den omfattende armamentarium af adfærdsmæssige tests, såsom Basso, Beattie og Bresnahan (BBB) score36. Gangparameteren Base of Support er blevet rapporteret til at stige efter centralnervede skader, sandsynligvis for at tage højde for en resulterende instable gangart. Base of Support blev væsentligt ændret fra baseline fra WPO10 til WPO14 i vores model, støtte vores formodning om, at denne parameter giver mulighed for vurdering af løbet af funktionelle opsving af AGA efter thorax spinal cord contusion skade.
Vi er overbeviste om, at AGA er et muligt redskab til at evaluere funktionel genopretning hos gnavere med skader på nervesystemet. Ikke desto mindre anbefaler vi at afspejle de observerede ændringer af gangart omhyggeligt og grundigt i hver respektive eksperimentelle setup. Ændringer i gangeparametre, fx en stigning i udskriftsområdet efter en øjeblikkelig postoperativ nedgang eller et fald i Svingtid, der fortsætter en umiddelbar postoperativ forhøjelse af denne parameter, i løbet af observationsperioden, vedrører ikke nødvendigvis funktionel genopretning. I stedet disse ændringer kan også være relateret til en mulig funktionel tilpasning til at opretholde en diskret gangart, da rotter er et bytte arter og forsøge at undgå at vise smerte eller handicap til potentielle rovdyr51. Det anbefales derfor at bruge automatiseret ganganalyse som et supplerende redskab til at relatere ændringer af gangart til andre resultat mål for perifere nerveskader og regenerering21. Som tidligere nævnt mener vi også, at det bør nøje afspejles, hvis gnavere med iskiasnerven neurotmesis bør undersøges ved hjælp af AGA som vores konstatering tyder stærkt på, at funktionel genopretning er stærkt begrænset i dette tilfælde.
Som det fremgår af vores arbejde, AGA vigtigste aktiv er muligheden for at studere både motoriske og sensoriske reinnervation i en lang række eksperimentelle PNI modeller samt CNI samtidig kun kræver én opsætning. Derfor er metoden efter vores mening et meget værdifuldt værktøj til omfattende neurobehavioral test. En af AGA’s aktiver, som er muligheden for at studere motoriske og sensoriske reinnervation i forskellige dyremodeller af PNI og CNI, mens der kun kræver én opsætning, er efter vores mening metodens største fordel i forhold til andre evalueringsmetoder til at studere funktionel opsving, såsom walking track analyse52, Von Frey test53, eller gangart kinematik16. Potentialet til samtidig at evaluere ændringer af gangart, som enten korrelerer med resultaterne af elektrofysiologiske undersøgelser af reinnerverede muskel22 eller evalueringsmetoder for sensorisk funktion54 er lovende med hensyn til fremtidige anvendelser af metoden. Vi anbefaler derfor at bruge AGA til at undersøge funktionel opsving i gnavere modeller af forelimb PNI, såsom ulnar, radial, eller median nerve, eller eksperimentelle nerveoverførsel modeller55, som forbliver uudstået med denne metode endnu.
Vi giver hermed en detaljeret protokol om, hvordan man bruger automatiseret gangart analyse til at studere funktionel helbredelse i tre gnaver modeller af nerveskade. Mens metoden kræver nøje overvejelse af forskellige centrale aspekter såsom passende uddannelse og omhyggelig hard- og software kalibrering, er det et muligt og værdifuldt supplerende værktøj til at evaluere nerve regenerering i gnavere modeller af centrale og perifere nerveskade.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Karin Brenner for hendes lidenskabelige pasning af dyrene. Forfatterne vil også gerne takke Claudia Keibl, James Ferguson, Gabriele Leinfellner og Susanne Drechsler for deres hjælp under de eksperimentelle operationer.
0.9% Saline | B. Braun Austria | 3570410 | Vehicle for drug delivery |
1 ml syringe | B. Braun Austria | 9161708V | Injecting device |
10 ml syringe | B. Braun Austria | 4606728 V | Injecting device |
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin | Gebro Pharma | N/A | Alcoholic skin disinfection |
23-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657667 | Canula for s.c. injection |
26-gauge (G) canula | B. Braun Austria | 4657683 | Canula for s.c. injection |
5 ml syringe | B. Braun Austria | 4606710 V | Injecting device |
Buprenorphine hydrochloride | Sigma | B9275 | Analgetic agent |
Burrs for Micro Drill | F.S.T | 19007-29 | Drilling of a hole inside the lamina |
Caprofen | Zoetis Austria | N/A | Analgetic agent |
Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of animal gait |
Cauterizer Kit | F.S.T | 18010-00 | Cauterization of vessels during surgery |
Enrofloxacin | Bayer Austria | N/A | Antibiotic |
Ethilon (10-0) | ETHICON | 2810G | Suture material for neurrorhaphy |
Ethilon (11-0) | ETHICON | EH7465G | Suture material for neurrorhaphy |
Eye ointment | Fresenius Kabi Austria | 4302436 | Eye protection during anesthesia |
Friedman-Pearson Rongeurs | F.S.T | 16221-14 | Surgical instrument |
Gabapentin | Wedgewood Pharmacy | N/A | Analgetic agent |
Goldstein retractor | F.S.T | 17003-03 | Retraction of tissues during surgery |
Hair trimmer | Aescular | N/A | Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery |
Heating Pad for rodents | ALA Scientific Instruments | N/A | Regulation of body temperature |
Impactor | Precision Systems and Instrumentation | N/A | Induction of spinal cord contusion |
Lewis rat () | Janvier | N/A | Experimental animal |
Magnetic Fixator Retraction System | F.S.T | 18200-50 | Retraction of tissues during surgery |
Metzenbaum Baby Scissors | F.S.T | 14019-13 | Surgical instrument |
Micro Drill | Word Precision Instruments | 503599 | Instrument for bone drilling |
Micro Needle holder | F.S.T | 12076-12 | Surgical instrument |
Micro-scissors (curved) | F.S.T | 15023-10 | Surgical instrument |
Micro-scissors (straight) | F.S.T | 15007-08 | Surgical instrument |
Mirror Finish Forceps | F.S.T | 11251-23 | Surgical instrument |
Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
Operating microscope | Leica | M651 MSD | Magnification of the operative site |
Povidone Iod | B. Braun Melsungen | N/A | Non-alcoholic skin disinfectant |
Pulse Oximeter | STARR Life Sciences | N/A | Surveillance of heart rate and oxygen saturation |
Rodent thermometer | BIOSEB | BIO-TK8851 | Surveillance of body temperature |
Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%) | Baxter | HDG9117A | Anesthetic |
Spatula & Probe | F.S.T | 10090-13 | Surgical instrument |
Sprague Dawley rat () | Janvier | N/A | Experimental animal |
Sterila gauze 5x5cm | EVAC MEDICAL | E010.03.00215 | Sterile gauze compress |
Tissue Forceps | F.S.T | 11021-12 | Surgical instrument |
Vicryl (4-0) | ETHICON | V3040H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl (5-0) | ETHICON | V303H | Suture material for subcutaneous sutures |
Vicryl cutting needle (4-0) | ETHICON | V392ZH | Suture material for skin sutures |
Vicryl cutting needle (5-0) | ETHICON | V391H | Suture material for skin sutures |