이 프로토콜은 표적 단백질에 융합된 항체가 없는 내인성 단백질 검출 태그를 발현하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 조작된 살아있는 세포에서 단백질 분해 역학의 정량적 발광 검출을 설명합니다. 정량적 분해 파라미터, 속도, Dmax, DC 50 및 Dmax50을 계산하고 얻기 위한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.
분자 접착제 또는 단백질 분해 표적 키메라를 포함한 표적 단백질 분해 화합물은 소분자 약물 발견에서 흥미로운 새로운 치료 방식입니다. 이 종류의 화합물은 유비퀴틴-프로테아좀 경로(UPP)를 통해 유비퀴타이닝하고 궁극적으로 표적 단백질을 분해하는 데 필요한 E3 리가아제 기계 단백질을 근접하게 가져와 단백질 분해를 유도합니다. 그러나 고처리량 방식으로 표적 단백질 분해를 프로파일링하는 것은 분해를 달성하는 데 필요한 세포 경로의 복잡성을 고려할 때 여전히 매우 어렵습니다. 여기에서는 발광 단백질을 생성하기 위해 LgBiT 단백질에 대한 높은 친화도를 보완하는 11개 아미노산 HiBiT 태그와 함께 표적 단백질의 CRISPR/Cas9 내인성 태깅을 사용하는 프로토콜 및 스크리닝 전략을 제시합니다. 내인성 태그가 있는 이러한 CRISPR 표적 세포주는 발광판 기반 리더를 사용하여 발광 신호를 모니터링하여 실시간, 키네틱 라이브 셀 또는 종말점 용해 모드에서 화합물 유도 분해를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 다양한 형식에 대해 권장되는 스크리닝 프로토콜을 간략하게 설명하고 속도, Dmax, DC 50, Dmax50의 주요 분해 매개 변수 계산 및 세포 생존율 분석을 통한 멀티플렉싱에 대해서도 설명합니다. 이러한 접근법은 초기 단계 화합물의 신속한 발견 및 분류를 가능하게 하는 동시에 관련 세포 배경에서 표적 단백질의 내인성 발현 및 조절을 유지하여 선도 치료 화합물의 효율적인 최적화를 가능하게 합니다.
표적 단백질 분해는 소분자 약물 발견에서 가장 빠르게 성장하는 영역 중 하나로 부상했으며, 암 치료를 위한 면역 조절 분자 접착제 화합물(예: IMiD)의 치료 성공과 키메라 화합물 1,2,3,4,5,6,7,8을 표적으로 하는 단백질 분해의 유망한 초기 임상 시험 데이터에 의해 크게 강화되었습니다. 9,10,11,12. 표적 단백질 분해 화합물은 표적 단백질을 E3 리가아제 기계 단백질 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12와 근접하게 가져옴으로써 기능합니다. . 이 화합물-유도된 표적 단백질의 E3 리가아제는 유비퀴틴 프로테아좀 경로(UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 통한 표적 단백질 유비퀴틴화 및 분해를 유도합니다. . 역사적으로 저분자 약물 발견 스크리닝 프로그램은 활성을 평가하고 화합물의 순위를 매기기 위해 초기 생화학 분석에 의존해 왔습니다. 그러나, 이는 프로테아좀을 통한 분해 가 세포 사건 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17의 캐스케이드에 의존하는 표적 단백질 분해제에게 중요한 도전을 제시했으며, 18. 성공적인 표적 분해에 필요한 단백질 복합체의 여러 경로와 복잡성으로 인해 초기 화합물의 조기 스크리닝 및 분류를 위한 세포 분석 접근법이 필요합니다. 현재, 세포 환경의 맥락에서 고처리량 방식으로 표적 단백질 분해를 모니터링하는 기술의 가용성은 심각하게 부족하다14. 여기에서는 분해제 화합물 10,11,18,19로 처리한 후 발광 측정을 통해 표적 단백질의 손실을 모니터링하기 위해 CRISPR/Cas9 내인성 태그가 붙은 HiBiT 표적 세포주18,19,20을 사용하여 실시간 키네틱 라이브 셀 또는 종말점 용해 분해 활성 평가를 위한 프로토콜을 제시합니다.
치료 표적의 성공적인 분해를 달성하고 약물성 프로테옴을 확장하기 위해, 원형질막, 리소좀, 미토콘드리아 막, 세포질 및 핵21-57에 국한된 단백질을 포함하여 파괴를 위한 광범위한 단백질을 표적화할 수 있는 수많은 접근법 및 유형의 분해제가 등장했습니다. 가장 광범위하게 연구된 화합물의 두 가지 주요 부류는 분자 접착제와 시메라 2,4,5,6,7,12,26을 표적으로 하는 단백질입니다. 분자 접착제는 1가이므로 일반적으로 크기가 더 작으며 E3 리가아제 성분 2,12,26에 결합할 때 표적 단백질과의 새로운 단백질:단백질 상호작용 인터페이스를 촉진합니다. 이들은 가장 일반적으로 Cereblon (CRBN) E3 리가 아제 성분 2,12,26,55,56,57에 결합하는 분해 인자입니다. 최근 DCAF1558,59,60 및 DDB145에 대한 CDK/Cyclin 모집과 같은 다른 E3 리가제 기계를 활용하는 흥미로운 새로운 사례는 이러한 종류의 화합물의 확장 가능성을 보여줍니다. 대조적으로, PROTAC는 표적 결합 리간드로 구성된 더 큰 2가 분자이며, 대부분 억제제이며 화학 링커를 통해 E3 리가 아제 핸들 1,3,4,5,7,13에 연결됩니다. 이와 같이, 이들 화합물은 E3 리가아제 및 표적 단백질 1,3,4,5,7,13 모두에 직접 결합할 수 있다. 수많은 단백질이 이러한 2가 분자를 통해 분해되는 것으로 나타났으며 가장 많이 사용되는 E3 리가아제 핸들은 CRBN 또는 Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13을 모집합니다. 그러나, 단백질 분해 설계를 표적으로 하는 키메라에서 E3 리가제 모집에 사용할 수 있는 핸들의 수가 빠르게 증가하고 있으며, 다양한 표적 클래스를 분해하고 세포 또는 조직 유형 특이성을 향상시킬 수 있는 잠재력을 가진 이 계열의 화합물의 기능이 확장되고 있습니다.24,48,61,62 . 한계 친화력에도 불구하고 표적 단백질에 관여하기 위한 최소한의 요구 사항과 결합하여, 분해 화합물은 약물성 프로테옴을 확장할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.
단백질 손실의 세포 역학과 치료 후 잠재적인 단백질 회수를 특성화하는 것은 분해 화합물 기능 및 효능을 이해하는 데 중요합니다. 웨스턴 블롯 항체 분석 또는 질량분석법을 사용하여 관련 세포 시스템에서 내인성 단백질 수준 변화를 연구하는 것이 가능하지만, 이러한 접근법은 고처리량 스크리닝 형식에 적응하기 어렵거나, 정량화 능력이 제한적이거나, 많은 시점에서 운동 변화를 측정하는 능력이 있습니다14. 이러한 문제를 해결하기 위해 자사는 내인성 단백질 수준의 변화를 모니터링하기 위한 플레이트 기반 세포 발광 시스템을 개발했으며, 이 시스템은 11개 아미노산 태그인 HiBiT의 CRISPR/Cas9를 통해 주요 분해 표적18,19,20의 유전자좌에 게놈 삽입을 활용합니다. 이 펩타이드는 결합 파트너 인 LgBiT에 대한 높은 친화력으로 보완되어 기질 18,19,20,63의 존재하에 밝은 발광을 생성하여 이러한 태그가 부여 된 내인성 단백질을 세포 또는 용해물 18,19,20,63에서 발광시킵니다. . 루미노미터 기기로 측정한 상대 조명 단위(RLU)는 태그가 지정된 표적 단백질 수준 18,19,20,63에 정비례합니다. 안정화된 루시퍼라아제 기질의 개발로 24-48시간 프레임에 걸친 실시간 운동 단백질 수준 측정이 가능합니다(18,53,64). 이를 통해 초기 분해 속도, 분해 최대(Dmax) 및 화합물 처리 후 회복(18,53)의 정량 분석을 포함하여 주어진 화합물 농도에서 임의의 주어진 표적에 대한 완전한 분해 프로파일을 결정할 수 있습니다. 그러나 분해 화합물의 대규모 라이브러리를 스크리닝하는 경우 다양한 약물 농도와 지정된 시간에 384웰 형식으로 종말점 분석을 쉽게 수행할 수도 있습니다.
이 원고에 제시된 프로토콜은 모든 유형의 분해제에 적용 가능한 표적 단백질 분해 화합물에 대한 세포 스크리닝 전략을 나타냅니다. 그러나 이러한 프로토콜과 함께 HiBiT CRISPR 세포주의 사용은 단백질 분해에 국한되지 않고 화합물 또는 심지어 내성 메커니즘의 영향을 연구하기 위해 처리 후 조절될 수 있는 내인성 표적 단백질 수준을 모니터링하기 위한 일반적인 도구입니다 20,65,66. 이러한 발광 기반 검출 방법의 전제 조건은 CRISPR 내인성 태그가 부착된 HiBiT 표적 세포주이며, 이는 내인성 표적 발현 및 천연 프로모터 조절18,19,20을 유지하면서 민감한 발광 검출을 가능하게 하기 때문에 중요합니다. 게놈 태그 삽입을 위해 CRISRP/Cas9를 활용하는 데 있어 상당한 발전이 이루어졌으며, 특히 확장성 20 및 검출 민감도가 높으며, CRISPR 풀 또는 이형접합체 또는 동형접합 대립유전자 삽입18,19,20이 있는 클론을 포함한 다양한 형식에서 이루어졌습니다. 내인성 태깅 대신에 세포에서 HiBiT 또는 다른 리포터 융합체의 외인성 발현의 사용이 가능하지만, 단백질 과발현14,18을 갖는 시스템을 사용하여 상당한 주의를 기울여야 한다. 이는 표적 분해 후 활성화된 잠재적인 전사 피드백 루프를 포함하여 진정한 화합물 효능 및 단백질 회복 역학(14,18)을 이해하는 인공물로 이어질 수 있습니다. 또한 효능이 낮은 초기 단계의 화합물을 놓칠 수 있으며 스크리닝에서 위음성으로 나타날 수 있습니다. 단백질 손실은 화합물 유도 독성 및 세포 사멸로 인해 발생할 수 있으므로 여기에 설명된 프로토콜에는 분해 프로토콜과 쌍을 이루는 적극 권장되지만 선택적인 세포 생존율 발광 또는 형광 분석이 포함되어 있습니다. 프로토콜에는 용균 종말점과 라이브 셀 키네틱 스크리닝이라는 두 가지 주요 섹션이 있습니다. 이러한 각 섹션 내에는 종말점 또는 동역학 형식의 멀티플렉스 세포 생존율 측정을 위한 옵션이 포함되어 있습니다. 태그가 부착된 내인성 단백질의 변화를 모니터링하려면 세포에서 LgBiT를 보완해야 합니다. 따라서, 키네틱 스크리닝 섹션은 이것의 도입을 위한 중요한 프로토콜을 참조하며, 이는 일시적 또는 안정한 발현을 통해 달성될 수 있고, 살아있는 세포 발광 측정을 수행하는 데 필수적이다. 여기에 제시된 모든 접근 방식은 화합물의 신속한 순위 순서 및 활성 평가를 허용하여 초기 단계의 화합물 스크리닝 노력과 납 분해자의 보다 신속한 식별을 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 HiBiT CRISPR 세포주와 함께 분해 화합물을 연구하도록 설계되었습니다. 수많은 표적에 대한 HiBiT CRISPR 삽입의 생성을 위한 프로토콜은 최근의 여러 간행물18,19,20에 요약되어 있다.
여기에서는 종말점 용균 형식 또는 생세포 동역학 모드에서 분해 화합물 활성을 스크리닝하는 두 가지 방법을 제시합니다. 이러한 접근 방식은 동일한 발광 측정 원리를 기반으로 하지만 서로 다른 수준의 세부 사항과 이해를 제공합니다. 두 접근법 중 하나의 선택은 스크리닝 목표와 복합 라이브러리의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 검출 가능한 분해를 관찰하기 위한 대형 화합물 스크리닝 데크 또는 1차 스크리닝의 경우, 웨스턴 블롯 또는 질량분석법과 같은 다른 종말점 접근법이 비실용적이거나 적응하기 어려울 수 있는 민감하고 효율적인 고처리량 호환성을 제공합니다14. 이들 스크린의 시작점은 제한된 수의 농도 및 시간점으로 수행될 수 있다. 테스트에 권장되는 초기 농도는 100nM-10μM 범위이며, 초기 분해제는 효능이 낮고 투과성이 좋지 않거나 경우에 따라 매우 강력한 화합물의 경우 후크 효과가 있는 것을 설명합니다. 또한 4-6 시간에 조기 발병 저하와 18-24 시간에 잠복 또는 지속적인 저하를 설정하기 위해 최소 두 개의 다른 시점을 테스트하는 것이 좋습니다. 높은 분해 효능 및 표적 메커니즘을 나타내는 화합물은 4-6시간 내에 쉽게 관찰되는 반면, 이후 시점에서만 관찰되는 분해 또는 명백한 단백질 손실은 다양한 메커니즘으로 인한 것일 수 있습니다. 단백질 손실이 세포 사멸로 인한 손실과 분리될 수 있도록 초기 및 후기 시점 모두에서 세포 생존율을 모니터링하는 것이 좋습니다. 모든 유형의 발광 또는 형광 분석과 유사하게, 라이브러리 내의 화합물이 신호를 방해하거나 억제할 가능성이 있으므로, 단백질 수준을 모니터링하기 위한 관련 없는 융합 또는 대체 접근법을 사용하는 납 화합물에 대한 직교 후속 실험은 이러한 분석에서 RLU의 손실이 표적 단백질 분해와 직접적으로 연관되어 있음을 평가하는 데 중요합니다.
장기간에 걸쳐 살아있는 세포 동역학 형식으로 스크리닝하는 능력은 배경에 대한 분석 신호에 크게 의존합니다(S:B). S:B에 기여하는 인자에는 표적 단백질 자체의 발현 수준, 펩타이드 삽입을 위해 선택된 세포주에서의 LgBiT 발현 효율, 다양한 네이티브 복합체에서 보완을위한 태그가 지정된 표적의 가용성. 우리는 Endurazine 또는 Vivazine을 사용하여 운동 모드에서 분해를 성공적으로 측정하기 위해 15의 S:B로 구성된 일반적인 컷오프 요구 사항을 설정했습니다. S:B는 엔두라진 또는 비바진 생세포 기질의 존재 하에 LgBiT 단독을 발현하는 편집되지 않은 모 세포와 비교하여 LgBiT를 공동 발현하는 HiBiT-편집된 세포의 기준선 신호를 측정함으로써 결정된다. 비바진은 더 높은 발광 신호를 생성하지만 엔두라진보다 더 빨리 붕괴되며 신호 획득을 24시간 이하로 제한할 수 있습니다. 또한 S:B는 CRISPR 풀 또는 클론 사용 여부에 따라 크게 달라질 수 있습니다. CRISPR/Cas9 엔지니어링에 더 적합하고 효율성이 높은 세포주의 표적의 경우, 편집된 세포의 이질적인 CRISPR 풀 집단은 동역학 분석을 위한 충분한 S:B를 가질 수 있습니다. CRISPR을 통한 덜 효율적인 게놈 통합으로 인해 S:B가 낮은 풀이 생성되는 더 어려운 세포주의 표적의 경우, 편집된 집단을 풍부하게 하고 동역학 분석을 위해 충분히 높은 S:B를 달성하기 위해 CRISPR 클론을 분리해야 할 수 있습니다. 이러한 시나리오 중 하나라도 S:B가 엔두라진 또는 비바진 기질로 15 미만이면 종말점 용균 스크리닝이 권장됩니다.
정량적 파라미터를 사용한 분해 프로파일의 결정을 포함하여 화합물의 더 나은 이해 및 특성화를 위해, 살아있는 세포에서의 실시간 동역학 분석이 권장되는 스크리닝 접근법14,18입니다. 위에서 논의한 종말점 분석과 마찬가지로 초기 키네틱 스크리닝은 고처리량 방식으로 100nM-10μM 범위의 제한된 수의 농도로 수행할 수 있습니다. 384웰 형식에서는 100개 이상의 화합물을 단일 플레이트에서 한 농도로 삼중으로 쉽게 스크리닝할 수 있습니다. 결과적인 분해 프로파일은 관찰된 분해 정도뿐만 아니라 분해 속도, 분해 기간 및 단백질14,18의 잠재적 회수에 대한 지침을 제공합니다(그림 2 및 그림 3). 분해 프로파일의 모양도 귀중한 정보를 제공합니다. 특이적이고 강력한 분해제는 종종 시간18,53 만에 고원으로 표적 단백질의 초기 빠른 손실을 보이는 반면, 전사 피드백 또는 화합물 독성과 같은 다른 메커니즘은 일반적으로 시간이 지남에 따라 단백질의 더 선형적인 손실을 초래합니다. 이러한 세부 사항과 뉘앙스는 종말점 용균 분석에서 누락되며 24-48시간에 걸친 실시간 분석을 통해 신규 또는 알려지지 않은 화합물 세트 내에서 실제 Dmax를 캡처하는 시간을 예측할 필요가 없습니다.
실시간 동역학은 또한 화합물 효능, 화합물 농도가 초기 분해 속도에 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해 효율적인 용량 반응 스크리닝을 허용하고 둘 이상의 매개 변수를 기반으로 화합물의 순위를 매길 수 있는 가능성을 제공합니다. 분해 효능의 고전적인 측정에는 명백한 분해 최대값을 기반으로 특정 시점의 DC50 계산이 포함됩니다. 대조적으로, 효능을 평가하기 위한 당사의 동역학적 접근 방식은 시간18에서 언제 발생하는지에 관계없이 각 농도에서 실제 분해 최대값을 통합합니다. 우리는 이러한 운동 분해 효능 측정을 Dmax5018이라고 부릅니다. 이러한 방식의 분석은 더 낮은 농도에서 더 천천히 분해를 시작할 수 있으므로 처리 후 Dmax에 도달하는 데 더 오랜 시간이 걸리는 화합물을 설명합니다. 분해 속도와 Dmax 모두에서 화합물의 순위를 매기는 것이 특히 유익할 수 있습니다. 가장 강력한 분해자의 경우 이것은 느리지 만 강력한 분해 물질을 빠르고 강력한 분해 인자와 더욱 구별합니다. HiBiT CRISPR 세포주를 활용한 용균 및 생세포 키네틱 스크리닝은 표적 단백질 분해, 화합물 기능에 대한 보다 포괄적인 그림을 제공하고 주요 분해 매개변수의 향상을 통해 초기 활성 평가에서 다운스트림 화학적 최적화에 이르는 스크리닝 프로세스를 가능하게 하는 강력한 접근 방식입니다.
The authors have nothing to disclose.
K.M.R, S.D.M, M.U. 및 D.L.D는 모두 Promega Corporation의 직원입니다.
CellTiter-Glo 2.0 reagent | Promega | G9241 | Cell Viability luminescent assay |
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay | Promega | G6080 | Cell Viability fluorescent assay |
CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045-088 | Cell culture |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | For compound dilution and control |
DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
Fetal Bovine Serum | Seradigm | 89510-194 | Cell culture |
HEK293 LgBiT stable cell line | Promega | N2672 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
HiBiT CRISPR mammalian cell line | Promega | https://www.promega.com/crispr-tpd | |
Hygromycin B solution | Gibco | 10-687-010 | Cell culture |
LgBiT BacMam | Promega | CS1956C01 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
LgBiT Expression Vector | Promega | N2681 | For complementation with HiBiT to generate luminescence |
Luminometer Plate Reader | Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000) | ||
NanoGlo Endurazine live cell substrate | Promega | N2570 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo Vivazine live cell substrate | Promega | N2580 | Kinetic HiBiT reagent |
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system | Promega | N3030 | Enpoint lytic HiBiT reagent |
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher) | ThermoFisher | 11058-021 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 96 well plate | Costar | 3917 | Cell culture |
Tissue culture plates, white, 384 well plate | Corning | 3570 | Cell culture |
Trypsin/EDTA | Gibco | 25300 | Cell culture |