在这里,我们提出了使用pAdEasy系统进行腺病毒生产的协议。该技术包括重新组合pAdTrack和pAdEasy-1质粒,腺病毒包装和放大,从细胞赖酸和培养基净化腺病毒颗粒,病毒滴定,和腺病毒的功能测试。
腺体转导具有强而瞬时诱导利益基因表达到各种细胞类型和器官的优点。然而,重组腺苷技术是费力的,耗时的,昂贵的。在这里,我们提出了一个改进的协议,使用pAdEasy系统获得纯化腺苷颗粒,可以诱导一个强大的绿色荧光蛋白(GFP)表达在转导细胞。与伯特·沃格尔斯坦开发的原始方法相比,这种改进方法的优点是准备更快,生产成本更降低。腺素技术的主要步骤是:(1) 将 pAdTrack-GFP 与 BJ5183 细菌中的 pAdEasy-1 质粒重组:(二)腺苷颗粒的包装:(3) AD293细胞中腺病毒的扩增:(四)从细胞化解水合物、培养介质中净化腺苷颗粒的:(5) 腺病毒的病毒滴定和功能测试。对原始方法的改进包括:(一) 通过细菌的化学转化,对含有BJ5183的pAdEasy-1进行重组:((二) 选择”负”和”正”PCR的重组克隆:(三) 使用K2转染系统进行腺体包装的AD293细胞的传输:(四) AD293细胞在细胞培养介质中释放的病毒颗粒硫酸铵的沉淀:(五)通过一步氯化钠不连续梯度超集中净化病毒。在不同类型的转导细胞(如肝细胞、内皮细胞)中,从各种来源(人类、牛、穆林)中获得了兴趣基因的强烈表达(在此例中为GFP)。腺活体介质基因转移是开发现代基因疗法的主要工具之一。
腺病毒是含有核胶囊和双链线性DNA基因组1,2,3的非病毒。腺病毒可以感染广泛的细胞类型和感染不依赖于活性宿主细胞分裂。感染后,腺病毒将其基因组DNA引入宿主细胞核,在那里它保持史诗色素,并与宿主的基因一起转录。因此,插入突变或异基因调节的潜在风险最小达到4,5,6。腺病毒基因组不与宿主基因组一起复制,因此,腺病毒基因在分裂的细胞群中被稀释。在腺素转化的优点中,有:(一) 高水平的转基因表达:(二) 由于表皮表达,减少与病毒DNA整合到宿主基因组相关的风险:(三) 各种分割和非分裂细胞类型的转导。生物医学研究中使用的大多数腺病毒都是非复制性的,缺乏E1区域7、8、9。对于它们的生产,需要提供 E1 序列(如 HEK293)的单元线。此外,删除了病毒生命周期 (E3) 的非必要区域,以便在病毒基因组中插入转基因:其他地区(E2和E4)在一些腺病毒中进一步被删除,但在这些情况下,腺病毒产量下降和转基因表达低的报告7。
在这里,我们提出了一个改进的协议,用于使用 AdEasy 系统构建、包装和净化腺病毒。这些改进使腺病毒的包装速度更快,更经济,比伯特·沃格尔斯坦2,10开发的原始方法,由于以下优点:(一) 通过细菌的化学转化,在BJ5183含pAdEasy-1中重新组合:(二) 选择PCR的重组克隆:(三) 使用K2转染系统进行腺体包装的AD293细胞的传输:(四) 病毒包装和放大后培养介质中腺病毒颗粒的沉淀:(五) 使用一步氯化钠 (CsCl) 梯度超中心化进行腺素净化。
使用 AdEasy 系统(图 1)进行腺病毒生产的协议包括以下步骤:
(1) 在 BJ5183 细菌中用 pAdTrack-GFP 与 pAdEasy-1 进行重组
(2) 腺体颗粒的包装
(3) 扩增腺病毒
(4) 从细胞水合物和培养基中净化腺苷酸颗粒
(5) 腺病毒滴定。
图1:腺病毒生产技术。腺素技术的主要步骤是:(1) pAdTrack-GFP 与 BJ5183 细菌中的 pAdEasy-1 质粒的重组。选定的重组质粒在DH5+细菌中放大,然后纯化:(2) AD293细胞中产生腺-E1蛋白的腺苷颗粒的包装:(3) AD293细胞中腺病毒的扩增:(四)通过对CSCl密度梯度进行超集中,净化细胞裂解物和培养基中的腺苷颗粒:(5) 腺病毒的滴定和功能测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
在此协议中,我们体现了腺病毒的生产技术,该技术可诱导宿主细胞中 GFP 的表达。GFP 已插入第二个 CMV 促进器下的 pAdTrack-CMV 穿梭载体(添加基因#16405)的骨干,并用作报告基因(图 1)。因此,我们在此指定 pAdTrack-CMV 矢量为 pAdTrack-GFP,并评估了 GFP 的表达以示示范目的。除了GFP表达之外,该系统还可用于过度表达感兴趣的基因,该基因可能在pAdTrack-CMV的多个克隆站点克隆。与cDNA11相比,在pAdTrack-CMV中克隆的基因或微型基因通常更有效地进行表达感应。数据显示,来自不同来源(人类、牛、穆林)的转基因细胞(如肝细胞、内皮细胞)中具有很强的GFP表达。腺活体介质基因转移是开发现代基因疗法的主要工具之一。
重组腺病毒是基因传递和表达的多功能工具12,13,14。为了通过腺病毒转导诱导强蛋白表达,将感兴趣的基因编码序列插入腺病毒的基因组中。在伯特·沃格尔斯坦实验室开发的AdEasy腺病毒系统包括一个骨干质粒(pAdEasy-1),其中包含大多数野生型腺病毒血清型5基因组,以及一个用于基因克隆2,10的穿梭载体(pAdTrack)。删除腺病毒基因E1(负责传染性病毒颗粒的组装)和E3(参与逃避宿主免疫的编码蛋白)在腺病毒基因组中创造了一个空间,其中可以插入6.5-7.5 kb感兴趣的基因2,3。这个大小足以满足许多基因,特别是那些具有较短的直子15,16,17。也有研究人员报告,携带cDNA的基因18,19,20的腺病毒的生产。然而,我们获得的cDNA携带腺病毒的转基因表达的产量低于携带基因或微型基因的对应体(未显示的数据)。
改进和适应以前的方法2,10,14,18,21,腺苷生产技术需要更短的时间,更低的成本,更少的努力。全长腺病毒DNA是通过航天飞机载体和padEasy-1质粒在同源重组易感大肠杆菌株BJ5183之间的重组获得的。该协议意味着AdEasier-1细胞(BJ5183细菌含有padEasy-1)的化学转化。该技术不需要在某些实验室中可能不可用的电推进器,非常简单,可提高重组产量,并缩短获得合格细胞和进行转化所需的时间。PCR 进行的重组克隆的预选进一步缩短了时间,简化了整个过程。赵和同事22也使用了类似的程序,但是,在协议中,我们优化了引物的序列。
对于GFP-腺病毒的包装和放大,使用了 HEK293 衍生细胞系,即 AD293 细胞,它们更粘附于培养板。其他通常用于腺体生产的细胞系如下: 911, 293FT, pTG6559 (A549 衍生物), PER.C6 (HER 衍生品), GH329 (HeLa 衍生品), N52.E6和赫拉-E1 23,24,25,26。在我们手中,当使用911细胞时,腺体生产没有改善(数据未显示)。使用 K2 试剂的重组质粒对 AD293 细胞的传输显著提高了病毒包装步骤的效率。腺病毒生产后,高达 70% 的腺病毒仍在细胞内,并通过三个冻结和解冻周期释放。增加周期数是不适合的,因为它会破坏腺病毒。
在整个常规腺病毒生产过程中,细胞培养介质中释放出许多病毒颗粒。在收获受感染的AD293细胞时丢弃这种细胞培养介质会导致重要的病毒损失。我们优化了沙根和同事描述的协议,通过含硫酸铵27的降水来净化细胞培养介质中的腺苷颗粒。与使用聚乙二醇28的方法相比,该方法在细胞培养介质的腺病毒恢复方面效率更高。沉淀的腺病毒应立即通过超集中式净化或在冰箱中保存几天,但只有在透析后,才能去除过量的盐分。保持沉淀时间超过几个小时而不透析对病毒有害。
通过一步超集中式净化腺卵巢颗粒可减少对腺体储存的操纵,并简化与使用连续超中心化步骤14、29的协议相比的程序。对纯化腺病毒进行透析是消除氯化铀的必要手段,这种氯化物可能会进一步影响转导。在协议中,我们使用含有 MgCl2的 Tris 缓冲器,但不用于透析蔗糖,因为它需要大量不合理的蔗糖,否则需要作为冷冻的防腐剂。因此,我们后来加入蔗糖,直接进入准备冻结的腺苷油库存。为了避免净化腺病毒的频繁冻结和解冻,建议将腺病毒库存引用并储存在-80°C。 根据GFP报告器基因和转导细胞的百分比进行特定病毒稀释,通过流动细胞学对腺病毒滴定器进行了评估。与经典的”斑块检测”相比,这种方法更快,与评估不会揭示腺病毒颗粒感染能力的辣椒蛋白(通过各种方法,如ELISA或流动细胞测量)相比,它更值得信赖。但是,基于 ELISA 的定量、Q-PCR 或使用市售工具包进行斑块检测是替代方法,尤其可用于对不含荧光示踪剂的腺病毒进行滴定。
考虑到pAdTrack腺病毒源自人类腺病毒血清型5,这是公认的考克斯卡奇病毒和腺病毒受体(CAR),我们证明了GFP-a的能力 去传播人类起源的细胞(内皮细胞),但也转导其他起源的细胞:牛(内皮细胞)和穆林(脑脊髓细胞和肝细胞)。数据显示,GFP-腺病毒可以诱导转基因的高表达。
最后,我们优化了这项费力的技术,以减少获得腺苷颗粒所需的时间、成本和努力。准备的腺病毒能够感染各种细胞类型,并诱导兴趣基因的表达。由于腺活介质基因转移是开发现代基因疗法的主要工具之一,此协议可用于各种实验。
缩写: AdV-GFP,腺苷颗粒;BAEC,牛主动脉内皮细胞:氯化铀:GFP,绿色荧光蛋白;MSC,间质质频闪细胞;TU,传输单元。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由欧洲区域发展基金通过2014-2020年竞争力运营方案(POC-A.A.1.1.1.1.4-E-2015) 共同资助的项目提供支持, ID:P_37_668;缩写DIBETER),罗马尼亚研究和创新部的赠款PCCDI-UEFISCDI,项目编号PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697在PNCD III和罗马尼亚学院。作者感谢基里亚科斯·凯普罗斯(希腊帕特雷亚大学)的慷慨和相关建议,奥维迪乌·克罗托鲁(罗马尼亚布加勒斯特美术大学)的拍摄、电影编辑和平面设计,以及米海拉·布拉图的技术援助。
AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
LB medium | Formedium | LBx0102 | |
LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
Cell Scraper | TPP | 99003 | |
SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
Ultra-Clear Tubes (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
Water Bath | Memmert | WNB 14 |