هنا، نقدم بروتوكول لإنتاج الفيروس الغدي باستخدام نظام pAdEasy. وتشمل هذه التكنولوجيا إعادة دمج pAdTrack وpAdEasy-1 plasmids، والتعبئة والتغليف الفيروس الغدي والتضخيم، وتنقية الجسيمات أدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة، والحلمة الفيروسية، والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي.
إن النقل الأدينوفيرالي له ميزة الحث القوي والعابرة للتعبير عن جين الاهتمام في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأعضاء. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيا الأدينوفيرالية المؤتلفة شاقة وتستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هنا، نقدم بروتوكول محسن باستخدام نظام pAdEasy للحصول على جزيئات أدينوفيرالية نقية يمكن أن تحفز على تعبير بروتين فلوري أخضر قوي (GFP) في الخلايا المنقولة. مزايا هذه الطريقة المحسنة هي إعداد أسرع وانخفاض تكلفة الإنتاج مقارنة مع الطريقة الأصلية التي وضعها بيرت فوغلشتاين. الخطوات الرئيسية لتكنولوجيا أدينوفيرالي هي: (1) إعادة دمج pAdTrack-GFP مع pAdEasy-1 plasmid في البكتيريا BJ5183; (2) التعبئة والتغليف من الجسيمات أدينوفيرالية؛ (3) تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293؛ (4) تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة؛ و (5) المعايرة الفيروسية والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي. تتكون التحسينات على الطريقة الأصلية من (1) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا؛ و (2) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا؛ و (2) إعادة التركيب في BJ5183-1 بواسطة التحويل الكيميائي للبكتيريا. ‘2’ اختيار المستنسخين المستنسخين المستنسخين ب “سالب” و”إيجابي” من حيث ال PCR؛ ‘3’ نقل 293 AD الخلايا باستخدام نظام العدوى K2 للتغليف أدينوفيرالي؛ ‘4’ هطول الأمطار باستخدام كبريتات الأمونيوم للجسيمات الفيروسية التي تطلقها خلايا AD293 في وسط زراعة الخلايا؛ و(5) تنقية الفيروس عن طريق التدرج المتقطع من كلوريد السيزيوم من خطوة واحدة. تم الحصول على تعبير قوي عن جين الاهتمام (في هذه الحالة ، GFP) في أنواع مختلفة من الخلايا المنقولة (مثل خلايا الكبد والخلايا البطانية) من مصادر مختلفة (الإنسان والأبقار والمورين). يمثل نقل الجينات بوساطة أدينوفيرالية واحدة من الأدوات الرئيسية لتطوير العلاجات الجينية الحديثة.
الفيروسات الغدية هي فيروسات غير مجسمة تحتوي على نواة جينوم الحمض النووي الخطي المزدوج تقطعت بهم السبل1،2،3. يمكن أن تصيب الفيروسات الغدية مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والعدوى لا تعتمد على انقسام الخلايا المضيفة النشطة. بعد العدوى ، يدخل الفيروس الغدي حمضه النووي الجينومي في نواة الخلية المضيفة ، حيث يبقى epichromosomal ويتم نسخه مع جينات المضيف. وهكذا، يتم تحقيق الحد الأدنى من المخاطر المحتملة لتولد الطفرات الإدراجية أو تنظيم oncogenes4،5،6. لا يتم تكرار الجينوم الأدينوفيرالي جنبا إلى جنب مع الجينوم المضيف ، وبالتالي ، يتم تخفيف الجينات الأدينوفيرالية في مجموعة خلايا منقسمة. ومن بين مزايا النقل الأدينوفيرالي، هناك: ‘1’ مستويات عالية من التعبير المتحول؛ ‘2’ المستويات العالية من التعبير المتحول؛ ‘2’ المستويات العالية من التعبير المتحول؛ ‘2’ المستويات العالية من التعبير المتحول؛ ‘2’ المستويات العالية من التعبير المتحول؛ ‘2’ المستويات العالية من التعبير الجيني ‘2’ تقليل المخاطر المتصلة بدمج الحمض النووي الفيروسي في الجينوم المضيف، بسبب التعبير الظهاري؛ ‘3’ نقل طائفة واسعة من أنواع الخلايا الفاصلة وغير المقسمة. معظم الفيروسات الغدية المستخدمة في البحوث الطبية الحيوية هي غير متماثلة، تفتقر إلى منطقة E17،8،9. لإنتاجها، مطلوب خط الخلية توريد تسلسل E1 (مثل HEK293). إلى جانب ذلك، تم حذف منطقة غير أساسية لدورة الحياة الفيروسية (E3) للسماح بإدخال متحول في الجينوم الفيروسي. تم حذف مناطق أخرى (E2 و E4) في بعض الفيروسات الغدية ، ولكن في هذه الحالات ، تم الإبلاغ عن انخفاض غلة إنتاج الغدية والتعبير المنخفض عن المتحول7.
هنا، نقدم بروتوكولا محسنا لبناء الفيروسات الغدية وتعبئتها وتنقية باستخدام نظام AdEasy. سمحت هذه التحسينات بتعبئة الفيروس الغدي بطريقة أسرع وأكثر اقتصادا بالمقارنة مع الطريقة الأصلية التي طورها بيرت فوغلشتاين2،10، بسبب المزايا التالية: (1) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا ؛ (2) إعادة التركيب في BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1 عن طريق التحول الكيميائي للبكتيريا ؛ ‘2’ اختيار المستنسخين المؤتلفين بواسطة PCR؛ ‘3’ نقل 293 AD الخلايا باستخدام نظام العدوى K2 للتغليف أدينوفيرالي؛ ‘4’ هطول الجسيمات الأدينوفيرالية من وسط الاستزراع بعد التعبئة والتضخيم الفيروسيين؛ ‘5’ تنقية الأدينوفيرالية باستخدام جهاز طرد فائق فائق التدرج من كلوريد السيزيوم من خطوة واحدة.
بروتوكول لإنتاج الفيروس الغدي باستخدام نظام AdEasy (الشكل 1) يتضمن الخطوات التالية:
(1) إعادة دمج pAdTrack-GFP مع pAdEasy-1 في بكتيريا BJ5183
(2) تغليف الجسيمات الأدينوفيرالية
(3) تضخيم الفيروس الغدي
(4) تنقية الجسيمات الأدنوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة
(5) المعايرة من الفيروس الغدي.
الشكل 1: تكنولوجيا إنتاج الفيروس الغدي. الخطوات الرئيسية لتكنولوجيا أدينوفيرالي هي: (1) إعادة دمج pAdTrack-GFP مع البلازميد pAdEasy-1 في بكتيريا BJ5183. يتم تضخيم البلازميدات المختارة التي أعيد تركيبها في بكتيريا DH5α ثم تنقيتها. (2) تغليف الجسيمات الأدينوفيرالية في خلايا AD293، التي تنتج بروتينات أدينو-E1؛ (3) تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293؛ (4) تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية ووسط الثقافة عن طريق الطرد المركزي الفائق على تدرج كثافة CsCl؛ (5) المعايرة من الفيروس الغدي والاختبار الوظيفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في هذا البروتوكول، قمنا بأمثلة على تكنولوجيا إنتاج الفيروس الغدي، والتي يمكن أن تحفز التعبير عن GFP في الخلايا المضيفة. يتم إدراج GFP بالفعل في العمود الفقري لمتجه المكوك pAdTrack-CMV (أدجين #16405) ، تحت مروج CMV الثاني ويستخدم كجين مراسل(الشكل 1). لهذا السبب، قمنا هنا بتعيين المتجه pAdTrack-CMV ك pAdTrack-GFP وقيمنا التعبير عن GFP لأغراض إثباتية. وإلى جانب التعبير عن GFP، يمكن استخدام النظام للتعبير عن جين مثير للاهتمام، والذي يمكن استنساخه في مواقع الاستنساخ المتعددة ل pAdTrack-CMV. الجين أو المستنسخة في pAdTrack-CMV عادة ما تكون أكثر كفاءة للتحريض التعبير بالمقارنة مع cDNA11. وأظهرت البيانات تعبير GFP قوية في الخلايا المنقولة (مثل خلايا الكبد والخلايا البطانية) من مصادر مختلفة (الإنسان والأبقار والمورين). يمثل نقل الجينات بوساطة أدينوفيرالية واحدة من الأدوات الرئيسية لتطوير العلاجات الجينية الحديثة.
الفيروسات الغدية المؤتلفة هي أداة متعددة الاستخدامات لتسليم الجينات والتعبير12،13،14. للحث على التعبير البروتيني القوي عن طريق النقل الأدينوفيرالي ، يتم إدخال تسلسل ترميز جين الاهتمام في جينوم الفيروس الغدي. نظام AdEasy adenoviral، وضعت في مختبر بيرت فوغلشتاين، ويضم البلازميد العمود الفقري (pAdEasy-1) التي تحتوي على معظم نوع البرية الفيروس الغدي المصلي 5 الجينوم، وناقل مكوك (pAdTrack)، مصممةلاستنساخالجينات 2،10. حذف الجينات الأدينوفيرالية E1 (المسؤولة عن تجميع جزيئات الفيروس المعدية) و E3 (ترميز البروتينات المشاركة في التهرب من مناعة المضيف) خلق مساحة في الجينوم الأدينوفيرالي ، حيث يمكن إدخال جين من الفائدة من 6.5-7.5 كيلوبايت2،3. هذا الحجم يكفي لكثير من الجينات، وخاصة بالنسبة لأولئك الذين لديهم أقصر introns15،16،17. وهناك أيضا الباحثين الإبلاغ عن إنتاج الفيروسات الغدية تحمل cDNA من متحول18،19،20. ومع ذلك، حصلنا على عائد أقل من التعبير المتحول للفيروسات الغدية الحاملة لل CDNA مقارنة بنظرائهم الذين يحملون جينا أو جينا صغيرا (البيانات غير مبينة).
تحسين وتكييف الطرق السابقة2،10،14،18،21، تكنولوجيا لإنتاج أدينوفيرالي يتطلب وقتا أقصر ، وانخفاض التكلفة ، وأقل جهد. يتم الحصول على الحمض النووي الأدينوفيرالي كامل الطول عن طريق إعادة التركيب بين ناقل المكوك والبلازميد pAdEasy-1 في سلالة E. coli المعرضة للتضمين المتجانس ، BJ5183. يتضمن البروتوكول التحول الكيميائي لخلايا AdEasier-1 (بكتيريا BJ5183 التي تحتوي على pAdEasy-1). هذه التقنية لا تتطلب مطهر كهربائي قد لا تكون متاحة في بعض المختبرات، هو بسيط جدا، ويزيد من العائد إعادة التركيب، ويقلل من الوقت اللازم للحصول على الخلايا المختصة وإجراء التحول. كما أن الاختيار المسبق للمستنسخين المؤتلفين الذي يقوم به PCR يقلل من الوقت ويخفف من الإجراء بأكمله. تم استخدام إجراء مماثل من قبل تشاو وزملاء العمل22، ومع ذلك ، في البروتوكول ، قمنا بتحسين تسلسل العناوين التمهيدية.
بالنسبة لتغليف وتضخيم فيروس الغدة الحميدة GFP، تم استخدام خط خلايا مشتق HEK293، أي خلايا AD293، التي هي أكثر التزاما بلوحة الثقافة. خطوط الخلايا الأخرى المستخدمة عادة لإنتاج أدينوفيرالي هي التالية: 911، 293FT، pTG6559 (مشتق A549)، PER. C6 (مشتق لها)، GH329 (HeLa مشتق)، N52. E6، وهيلا-E123،24،25،26. في أيدينا، لم يتم الحصول على أي تحسن في إنتاج أدينوفيرالي عندما تم استخدام 911 خلية (البيانات غير مبينة). إن إصابة خلايا AD293 ببللازميد المؤتلف باستخدام كاشف K2 زادت بشكل كبير من كفاءة خطوة التعبئة والتغليف الفيروسية. بعد إنتاج الفيروس الغدي، ما يصل إلى ~ 70٪ من الفيروس الغدي لا يزال داخل الخلايا ويتم إطلاقه من قبل ثلاث دورات تجميد وذوبان الجليد. زيادة عدد الدورات ليست مناسبة لأنه يدمر الفيروس الغدي.
في جميع أنحاء عملية الإنتاج الأدينوفيرالي الروتينية ، يتم إطلاق العديد من الجسيمات الفيروسية في وسط زراعة الخلية. إن التخلص من هذه الوسيلة زراعة الخلية أثناء حصاد خلايا AD293 المصابة سيؤدي إلى فقدان الفيروسية الهامة. لقد قمنا بتحسين البروتوكول الذي وصفه Schagen وزملاء العمل لتنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من وسيط زراعة الخلايا عن طريق هطول الأمطار مع كبريتات الأمونيوم27. هذه الطريقة لديها كفاءة أعلى في استرداد الفيروس الغدي من الخلايا المتوسطة مقارنة مع طريقة استخدام البولي ايثيلين غليكول28. وينبغي تنقية الفيروس الغدي عجلت فورا عن طريق الطرد الفائق أو الاحتفاظ بها في الثلاجة لبضعة أيام ولكن فقط بعد غسيل الكلى، لإزالة فائض الملح. الحفاظ على عجل لفترة أطول من بضع ساعات دون غسيل الكلى ضار للفيروس.
تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية عن طريق الطرد المركزي الفائق التي أجريت في خطوة واحدة يقلل من التلاعب في المخزون أدينوفيرالي ويخفف الإجراء بالمقارنة مع البروتوكولات باستخدام خطوات الطرد الفائق المتعاقبة14،29. غسيل الكلى من الفيروس الغدي المنقى ضروري لإزالة كلوريد السيزيوم التي قد تؤثر بشكل أكبر على النقل. في البروتوكول، استخدمنا مخزن Tris المؤقت الذي يحتوي على MgCl2 ولكن ليس السكروز لغسيل الكلى، لأنه يتطلب كمية ضخمة وغير مبررة من السكروز المطلوبة بخلاف ذلك كمادة حافظة للتجميد. وهكذا، أضفنا السكروز في وقت لاحق، مباشرة إلى مخزونات أدينوفيرالية أعدت للتجميد. لتجنب التجميد المتكرر وذوبان الفيروس الغدي المنقى ، من المستحسن أن يتم تخزين المخزونات الأدينوفيرالية وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم تقييم التيتر الأدينوفيرالي عن طريق قياس التدفق الخلوي بالنظر إلى جين مراسل GFP والنسبة المئوية للخلايا المنقولة لتخفيف فيروسي محدد. هذه الطريقة أسرع بالمقارنة مع “فحص البلاك” الكلاسيكي وهي أكثر ثقة بالمقارنة مع تقييم البروتينات ذات الكبسولات (بطرق مختلفة مثل ELISA أو قياس التدفق الخلوي) والتي لا تكشف عن قدرة عدوى الجسيمات الأدينوفيرالية. ومع ذلك، فإن القياس الكمي القائم على ELISA، أو Q-PCR، أو فحص البلاك باستخدام مجموعات متاحة تجاريا هي طرق بديلة، مفيدة بشكل خاص لتكفير الفيروسات الغدية التي لا تحتوي على متتبع فلوري.
وبالنظر إلى أن الفيروسات الغدية pAdTrack مشتقة من الفيروسات الغدية البشرية من النمط المصلي 5 الذي يعترف به فيروس كوكساكي ومستقبلات فيروس أدينوفيروس (CAR)، أظهرنا قدرة فيروس الغدة الغددية GFP على تحويل الخلايا ذات الأصل البشري (الخلايا البطانية)، ولكن أيضا الخلايا ذات الأصول الأخرى: الأبقار (الخلايا البطانية) ومورين (الخلايا النجمية المتوسطة والخلايا الكبدية). وأظهرت البيانات أن فيروس الغدة الغامرة يمكن أن يحفز على مستوى عال من التعبير عن المتحولين جنسيا.
في الختام، قمنا بتحسين هذه التكنولوجيا الشاقة لتقليل الوقت والتكاليف والجهد اللازم للحصول على الجسيمات الأدينوفيرالية. الفيروس الغدي المعد قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا والحث على التعبير عن جين الاهتمام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من التجارب لأن نقل الجينات بوساطة أدينوفيرالية يمثل واحدة من الأدوات الرئيسية لتطوير العلاجات الجينية الحديثة.
الاختصارات: AdV-GFP، الجسيمات أدينوفيرالية؛ BAEC, الخلايا البطانية الأبهري البقري; CSCl، كلوريد السيزيوم؛ GFP، بروتين فلوري أخضر. MSC, الخلايا النجمية mesenchymal; TU، وحدات التحويل.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من خلال مشروع ممول من صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي من خلال البرنامج التشغيلي للقدرة التنافسية 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015، الهوية: P_37_668؛ اختصار DIABETER)، منحة من وزارة البحوث والابتكار الرومانية PCCDI- UEFISCDI، رقم المشروع PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 داخل PNCD III والأكاديمية الرومانية. يشكر المؤلفون كيرياكوس كيبريوس (جامعة باتراس، اليونان) على نصيحته السخية والوثيقة الصلة، أوفيديو كرويتو (جامعة الفنون الجميلة، بوخارست، رومانيا) للتصوير، وتحرير الأفلام، والتصميم الرسومي، ومهايلا براتو للحصول على المساعدة التقنية.
AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
LB medium | Formedium | LBx0102 | |
LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
Cell Scraper | TPP | 99003 | |
SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
Ultra-Clear Tubes (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
Water Bath | Memmert | WNB 14 |