线粒体融合是线粒体动力学基础的重要恒态反应。这里描述的是 一个体外 重组系统,研究线粒体内膜融合,可以解决膜系绳、对接、血融液和孔隙开口。讨论了该方法在探索细胞膜系统的多功能性。
线粒体动力学对于细胞器的不同功能和细胞反应至关重要。拥挤的、空间复杂的线粒体膜是区分调控因素的具有挑战性的环境。蛋白质和脂质成分的实验控制可以帮助回答特定的调控问题。然而,在细胞测定中,对这些因素的定量操作是具有挑战性的。为了研究线粒体内膜融合的分子机制,我们引入了一个模仿线粒in vitro体内膜脂质环境的体外重组平台。在这里,我们描述了准备脂质双层体和重组线粒体膜蛋白的详细步骤。该平台允许以定量方式分析线粒体内膜融合中的中间体,以及单个过渡的动力学。该协议描述了具有不对称脂质组合物的双层的制造,并描述了将转膜蛋白重组为缓冲双层的一般考虑因素。该方法可用于研究其他膜系统。
膜分块是真核细胞1的标志(图1A)。生物膜越来越被公认为二维溶剂,被认为是在调节蛋白质功能和大分子复合体组装2、3方面起着至关重要作用的环境。原生脂质是调节膜蛋白活性的配体3,3,4。膜空间组织和膜被雕刻成不同形状的能力是选择新功能3,5的重要物理属性。
模型膜平台是仿生系统,可以帮助我们了解细胞膜的结构,动力学和功能6,7,8。,7,8模型膜通常包括定义明确的组合物的脂质混合物,具有定义的生物物理特性(刚度、厚度和弹性)。结合荧光成像,模型膜平台允许对膜结构和功能9,10,1110进行定量分析。9脂质双层重组策略已用于研究SNARE中层膜融合9、10、DNA中介9,膜融合12、病毒融合11、13。11,13这种方法的优点是有可能获得可观察反应事件14之前的中间步骤的动力学信息。
利用模型膜对等离子膜进行了广泛的研究。已开发出具有脂相分离的双层,以研究在细胞信号11、15、16,中重要的脂,质筏结构。微层脂板双层17、18,18已用于研究细胞受体的组织。聚合物或凝胶支持的膜已被用作仿生系统,用于研究膜-细胞骨架组织、细胞信号期间的膜蛋白分割以及细胞接触体19的迁移。
人工膜系统也应用于研究亚细胞器20。组织具有创建不同子环境的特征形态。内质网(ER)网络就是一个例子。在将电核糖重新构成脂质体后,形成具有类似细胞ER特性的管状膜结构。添加的地图集素,一种ER融合蛋白,可以诱导脂质管从脂质体形成一个网络20。这是蛋白质体如何提供细胞器形态和动力学功能洞察的一个例子。
线粒体膜融合和裂变对线粒,体22、23、24、25,23,24等人群的健康至关重要。一组 dynamin 系列 GTPas 催化线粒体膜融合。Mfn 1/2 催化外膜融合。Opa1调解膜内融合26(图1B)。Opa1有两种形式:长形式(l-Opa1),跨膜锚定到线粒体内膜,和”可溶性”短形式(s-Opa1),存在于膜间空间。两种Opa1形式的比例由两个蛋白酶,Oma1和Yme1L27,28,29,3027,28,29,的活动调节。Opa1 法规中的重要问题包括:Opa1 的两种形式(短和长)如何调解膜融合及其调控相互作用 28、29、31、32、33。28,29,31,32,33
在这里,我们描述了一个成功应用于研究线粒体内膜融合的重组策略,该策略阐明了l-和s-Opa1在膜内融合中的角色。我们开发了一个平台,使用聚合物系绳脂双层和200nm单核囊泡模拟线粒体内膜。脂质双层层下方聚合物系绳的好处包括:首先,它保留了重组的跨膜蛋白,否则可能会因靠近玻璃滑梯34而中断。其次,它服务于脂质双层和玻璃基板之间的厚水层,这有利于孔隙开口9的研究,第三,PEG聚合物的粘弹性性质允许膜曲率变化35。我们使用三色荧光成像来描述膜融合中的步骤(图1C-F)。
图1:监测线粒体膜融合。
(A) 器官是细胞膜隔间。(B) 线粒体膜融合的连续步骤。线粒体外膜的融合由Mfn1和/或Mfn2催化,而内膜融合由Opa1进行调解。(C-F)体外 重组平台的 原理图研究线粒体膜融合。该平台包括两个部分:蛋白石体和聚合物系绳脂双层体,均具有重组的l-Opa1。荧光标签,包括两种不同的荧光膜染料和一个含量标记,有助于区分膜融合过程中的步骤。两个膜标记(Cy5-PE(红色)和德州红PE(橙色)使F FRET对,可以报告关闭膜对接。为蛋白体标记的德州红皮的扩散是脂质脱脂(血液)的指标。通过钙化物信号的除去监控内容释放(以绿色显示)。使用 Biorender 创建的面板 A 和 B。 请单击此处查看此图的较大版本。
体外模型膜系统可以描述在明确定义的条件下复杂的膜过程。这些系统可以区分复杂分子过程所需的最小成分,以揭示分子机制,6、15、20、38。15,20,38对于膜蛋白,脂质体和平面支持的双层层是常见的重组系统。与固体支持的脂质双层体相比,基板与支撑膜之间的聚合物缓冲允许大型膜蛋白和跨膜蛋白的自由移动,以自由扩散和组装34。这些功能帮助我们研究线粒体内膜融合36的动力学。
我们使用朗穆尔-布洛杰特/朗穆尔-舍费尔(LB/LS)技术准备了聚合物系绳脂双层玻璃。这使我们能够准备一个双层与不对称的脂质成分。细胞膜具有不对称的传单成分,LB/LS方法允许研究这种双层膜。通过舍费尔传输,整个玻璃基板可以覆盖脂质双层层。为双层准备准备一个干净的表面至关重要。此外,需要练习才能正确执行舍费尔传输。不成功的舍费尔转移可以在脂质双层层中产生不必要的缺陷。在此协议中,添加到薄膜平衡的压力适用于包含 20% 心力平的双层。对于具有其他部件的双层,请参阅关键部件的表面压力区域等温。另一种方法是Langmuir-Blodgett/囊泡融合(LB/VF)方法,其中底部脂质单层从朗穆尔槽的空水界面转移到干净的基材上,然后脂质体融合到支持的脂质单层的顶部,形成最终的双层39。使用LB/VF方法重组膜蛋白比LB/LS简单,因为可以通过蛋白体体融合进行重组。然而,囊泡融合需要增加多余的脂质体,这可能使依赖于浓度依赖蛋白-蛋白质相互作用的膜事件的研究复杂化。
将跨膜蛋白成功地重组为聚合物系绳脂双层体和脂质体,以首选功能方向进行重组非常重要,但很难实施。需要实验控制来解释这一点。对于聚合物系绳脂双层体,在重组过程中保持脂质双层体的完整性也很重要。表面活性剂浓度必须保持相对较低,以防止溶解脂质双层,但足够高,以防止感兴趣的蛋白质变性37,40。,40此处描述的方法非常适合为单分子研究重组膜蛋白,但不一定可扩展用于大规模研究。表面活性剂的选择是另一个重要的考虑因素。通常,用于纯化和储存的表面活性剂是一个很好的起点。表面活性剂的最大浓度通常比CMC36低200倍,在其中表面活性剂保持蛋白质稳定性并防止蛋白质聚集,同时保持膜36的完整性。可考虑使用含有 2 或 3 种表面活性剂的鸡尾酒。为了重新构成脂质体,不需要低浓度的表面活性剂。然而,CMC 以下的表面活性剂浓度最好保持脂质体的统一大小和形态分布。为了防止含量染料泄漏,有必要对含染料的缓冲液进行透析。
与基于脂体聚变的聚变分析相比,我们建立的平台提供了一种研究膜融合每个步骤动力学的方法。此方法提供了在接近原生条件下研究跨膜融合蛋白的能力。模型膜平台可用于研究膜蛋白组装和寡聚化、膜”雕刻”以及亚细胞环境中蛋白质的蛋白质脂质相互作用,如线粒体内膜。该方法还允许探索膜蛋白相互作用中的重要生理条件,如双层组合物不对称。关键线粒体脂质心电图在脂质体和聚合物支持的双层体的双层特性中的作用仍有待确定。离子强度、膜厚度、膜刚度、膜曲率和膜弹性粘度特性等特性都可能影响蛋白质组装到特定功能状态的能力。未来创造性地应用模型膜系统的研究有可能揭示膜蛋白组织和功能的新方面。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢查尔斯·胡德基金会儿童健康研究奖的支持以及马萨诸塞州总医院分子生物学系的慷慨支持。
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
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Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
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Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
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Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
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Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |