このプロトコルの目的は、蛍光標識されたリポソームを合成し、フローサイトメトリーを使用して細胞レベルでリポソームのin vivo局在を同定することです。
特に標的治療アプローチのために、in vivoで化合物を送達するためにリポソームを使用することへの関心が高まっています。リポソーム製剤に応じて、リポソームは、体内の異なる細胞型によって優先的に取り込まれ得る。これは、さまざまな疾患の進行が組織および細胞型特異的であるため、治療粒子の有効性に影響を与える可能性があります。このプロトコールでは、DSPC、コレステロール、およびPEG-2000 DSPEと脂質色素DiDを蛍光標識として使用して、リポソームを合成および蛍光標識する方法の1つを紹介します。このプロトコルは、in vivoでリポソームを送達し、フローサイトメトリーを使用してリポソームの細胞特異的取り込みを評価するためのアプローチも提示します。このアプローチは、リポソームを取り込む細胞の種類を決定し、細胞型および組織にわたるリポソーム取り込みの分布および割合を定量化するために使用することができる。このプロトコルでは言及されていませんが、免疫蛍光やサイトメーターでのシングルセル蛍光イメージングなどの追加のアッセイは、細胞内染色の評価を可能にするため、得られた所見や結論を強化します。プロトコルは、目的の組織に応じて適合させる必要がある場合もあります。
ナノ粒子の薬物送達を利用する治療法の開発への関心が高まるにつれて、粒子の分布と取り込みを調製および評価する方法は、進歩し続け、拡大し、研究コミュニティが利用できるようにする必要があります1,2。このプロトコルは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)-α/γアゴニストであるテサグリタザールを装填したDiD標識リポソームによる治療後にin vivoでリポソームを取り込んだ正確な細胞型を評価するために開発されました3,4。これらの研究では、どの細胞型がリポソームテサグリタザール治療によって直接影響を受けたか、標的部分の有効性を評価し、観察された治療結果を説明する仮説を立てることができました。さらに、様々な細胞種において確立された生物学的機能は、マクロファージ、樹状細胞、および肝臓特異的クッパー細胞などの貪食細胞がリポソームの大部分を占めることを示唆している5,6,7。このプロトコルを利用して、非古典的食細胞もリポソームを取り込むことができることを実証しました3,4。
このプロトコルは、テサグリタザールの可溶化、逆相蒸発によるリポソームの調製、および遠隔薬物ローディングの誘引剤として酢酸カルシウムを使用するための最適化された方法を提示します。提示された方法は、多くのラボでアクセス可能であり、入手が困難な材料や高温を必要とするステップが不足しています。このプロトコルは、in vivo8での循環の増加に最適なサイズのリポソームを生成します。さらに、Suらによって要約されているように、今日まで、インビボリポソーム分布および組織取り込みを評価する方法が詳細に研究および試験されてきた9。陽電子放出断層撮影法(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、および蛍光分子断層撮影法(FMT)法を適用して、組織特異的な生体分布と取り込みを定量化します9,10,11。これらの方法は、in vivoでの検出を最大化するように最適化されていますが、細胞分解能でin vivoでのリポソーム取り込みを定量化する能力はまだありません。ここで紹介するプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してこのニーズを達成することを目的としています。最後に、このプロトコルでは、細胞の取り込みを脂肪組織を含むいくつかの組織に絞り込みました。肥満、代謝異常、および炎症の設定で治療を提供するためにナノ粒子を使用する可能性を調査した文献が増えています12、13、14、15、16、17。そのため、これらの病態に重要な役割を果たす組織の一つである脂肪組織を処理・分析するための効果的な方法を共有することが重要であると考えました。
ここでは、(i)蛍光脂質色素で標識され、抗糖尿病化合物テサグリタザールを装填したリポソームを調製し、(ii)眼窩逆注射を介してマウスにリポソームを投与し、(iii)フローサイトメトリーによって細胞レベルでリポソームの取り込みを検出するための組織の採取、処理、および染色の3つの部分からなるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、約150μmのリポソームの調製と、脂肪、血液、および脾臓への取り込みの評価を確認します。リポソーム調製はスケーラブルで、主に室温で実行され、逆相蒸発を利用して薬物の負荷と有機溶媒の除去を最大化します。このプロトコルを使用すると、精製リポソームサンプルで最大2 mg/mLのテサグリタザール濃度を達成できます。調製したリポソームは、HEPESバッファーに4°Cで1年以上保存できます。私たちの経験では、彼らは平均粒子サイズの最小限の変動を示しました。薬物含量損失の10%未満は、10kDa遠心フィルターで外用薬物からリポソームを限外濾過分離した後、分光光度法で実証された。
リポソームの調製中、考慮すべきいくつかの重要なステップと要因があります。まず、プロトコルステップの順序は重要であり、遵守する必要があります。第二に、テサグリタザールの負荷時に使用される溶液のpHは、溶解度と効果的な負荷を最大化するために7.4に維持する必要があります。第三に、機器とフィルターを適切に組み立てることで、各ステップの出力が適切なサイズと純度になります。例えば、100 nmおよび200 nmのフィルターが適切に組み立てられていない場合、より不均一で不適切なサイズのリポソームのバッチが生じる可能性があります。第四に、リポソームへのテサグリタザールの移動を最大化するには、薬物ローディングの前に酢酸Caを完全に除去する必要があります。Ca-アセテートの完全な除去をテストするには、高速沈降を使用してリポソームを除去し、非リポソーム溶液中のCa-アセテートレベルを測定します。第五に、各ステップでリポソーム調製物に添加されたすべての材料の質量を秤量して記録することが重要です。これにより、適切な濃度が計算され、必要な材料の比率が維持されます。最後に、手法が適切に実行されない場合、望ましくないレベルの異質性が存在する可能性があります。DLSや電子顕微鏡などの他のアプローチを使用して、このパラメータを徹底的に確認することが重要です。均質性を向上させるには、選択したフィルターサイズを調整するか、2つのフィルターを積み重ねることを検討してください。
さらに、このプロトコルを完全に実施する前に、フローサイトメトリー用のコントロールと抗体パネルを計画および最適化することが重要です(表1、 表3)。抗体は、染色に適切な濃度が使用され、蛍光色素間のオーバーラップが最小限であることを確認するために試験する必要があります。リポソーム調製中に使用される色素の励起と放出も、パネル計画に考慮する必要があります。私たちの結果では、アロフィコシアニン(APC)やAlexaFluor 647などの蛍光色素と同様の励起と発光を持つDiDを利用しました。したがって、抗体パネルでは、これらの蛍光色素に結合した抗体を選択しませんでした。さらに、アイソタイプコントロールはこのプロトコルに含まれていません。これは、このプロトコル用に選択された抗体が十分に検証された市販の抗体であるためです。ただし、以前に最適化されていない抗体の使用に関心がある場合は、完全な実験を行う前に、目的の組織のアイソタイプコントロールに対して抗体をテストすることを検討してください。
このプロトコルは、マウスの後処理から血液、脾臓、鼠径脂肪、および精巣上体脂肪組織を抽出して処理する方法を示していますが、この一般的なアプローチは他の組織にも適用できます。目的の組織に応じて、次の組織について公開されているように処理および消化プロトコルを変更する必要がある場合があります:肺21、肝臓22、腹腔3、骨髄3,23、脳24。
考慮すべきこの方法の重要な制限は、摂取が動物ごとに1つの時点でしか評価できないことです。したがって、このプロトコルを他の非侵襲的イメージング技術と組み合わせるか、評価を実施するための十分なリソースを確保するためにそれに応じて計画することが有利な場合があります。リポソームは最初の24時間で全身を循環し、リポソームを取り込む細胞の寿命や取り込みに対する反応によっては、細胞死やさらなる食作用が起こる可能性があります。私たちの以前の研究は、異なる時点でのDiD+ 集団の集団特性の変化を示しました3。そのため、より早い時点または関心のあるメカニズムの生物学に最も関連する時点での取り込みを評価することが重要です。さらに、このプロトコルでは組織全体の細胞取り込みの定量化を行うことができますが、フローサイトメトリーでは組織の局在を明らかにすることはできません。このアプローチを組織学的手法と組み合わせると、この制限に対処するのに役立ちます。
一般に、このプロトコルは、組織学や全身蛍光イメージングなどの既存の方法論を補完します。フローサイトメトリーのツールと方法の継続的な進歩により、より多くの特異的な細胞集団に対するより大きなパネルの開発が可能になります。このプロトコルは、細胞取り込みの評価を改善し、フローサイトメトリーによって観察された結果を検証する機会も提供するため、前述の方法に加えて使用することを提案します。例えば、脂肪組織中の粒子の大部分がフローサイトメトリーによってマクロファージによって取り込まれたことがわかった場合。同じ脂肪組織の追加のアリコートの免疫蛍光を保存、固定、切片化、およびマクロファージマーカー用に染色して、細胞型が実際にリポソームを取り込むことを確認することができます。このアプローチは、実施されるナノ粒子生体分布アッセイに厳密さを追加するはずです:細胞特異的ターゲティングの検証、細胞取り込みの定量化、オフターゲット取り込みの特定、そしてうまくいけば、観察された治療結果のための機構的仮説を生成するための情報を提供します。このプロトコルは、さまざまなリポソームを使用した将来の研究、他の組織での取り込みの調査、肥満や代謝異常、またはナノ粒子送達が実行可能な治療オプションであるその他の疾患の設定における新しい化合物のテストにも適応できます。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、フローサイトメトリーのトレーニングとサービスを提供してくれたMichael Solgaと他のフローサイトメトリーコアスタッフに感謝したいと思います。著者らはまた、シヴァ・サイ・クリシュナ・ダーサ、ダスティン・K・ボークナイト、メリッサ・A・マーシャル、ジェームズ・C・ガーメイ、シャンテル・マクスキミング、アディティ・ウパディエ、プラサド・スリカクラプのリポソーム調製(SSKD、DKB)、組織採取(MAM、JCG)、フローサイトメトリー染色とサンプル取得(AU、PS、CM)を支援してくれたことに感謝したい。この研究は、アストラゼネカ、R01HL 136098、R01HL 141123およびR01HL 148109、AHA 16PRE30770007、およびT32 HL007284助成金の支援を受けました。
1-mL syringe | BD | 309659 | |
10-mL syringe | BD | 302995 | |
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
Sonicator | Misonix | XL2020 | |
T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |