Alle stappen in dit protocol zijn goedgekeurd door en volgen de richtlijnen van de Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Virginia. OPMERKING: Er zijn enkele belangrijke controles waarmee u rekening moet houden voor latere analysestappen, die zijn samengevat in tabel 1 en die moeten worden overwogen voorafgaand aan de toediening van liposoomen. 1. Bereiding van fluorescerend gelabelde liposomen, geladen met calciumacetaat en tesaglitazar Combineer DSPC (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine), cholesterol, PEG-2000-DSPE en DiD. Combime hiervoor de DSPC, cholesterol en PEG-2000 DSPE met een massaverhouding van 2:1:1. Voeg DiD-lipidenkleurstof toe in een concentratie van 1 mg DiD per 1 ml liposomen (molaire verhouding van 46:1 DSPC:DiD).OPMERKING: DiD is een geaccepteerde afkorting voor 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3’tetramethylindocarbocyanine kleurstof. Omdat het twee octadecyl “vette staarten” heeft van gelijke lengte als de DSPC die in deze formulering wordt gebruikt, moet het meestal in het lipidemembraan worden opgenomen. Lipidekleurstoffen zoals DiO, DiD en DiI worden routinematig gebruikt voor liposoomonderzoek8 en ze worden als niet-uitwisselbaar beschouwd18. Gebruik een scintillatieflacon van 20 ml voor de omgekeerde fase-emulsie en het liposoompreparaat. Meng in deze injectieflacon een 2:1 ether-chloroformoplossing van lipiden met waterig calciumacetaat (Ca-acetaat, 1 M, pH 7,4). De verhouding tussen de organische en de waterige fase moet 4:1 zijn, bijvoorbeeld 4 ml organische fase en 1 ml waterige fase. Emulgeer de ether-chloroform-oplossing van lipiden door sonicatie gedurende 30 s bij kamertemperatuur. Bedien de sonicator op 20 KHz en 50% vermogen en gebruik een 1/2 in. sonde.OPMERKING: Houd de punt van de sonicatorsonde dichter bij de onderkant van de injectieflacon om schuimvorming te voorkomen. Raak het glas niet aan met de sondepunt tijdens het ultrasoonapparaat, het kan breken. Bovendien moet chloroform als co-oplosmiddel aan de ether worden toegevoegd: in aanwezigheid van cholesterol scheidt een emulsie met alleen ether zich snel, waardoor deze stap van de procedure onmogelijk wordt. Plaats de injectieflacon met gehomogeniseerde water-in-olie-emulsie onmiddellijk op een roterende verdamper met een speciale adapter, manometermeter en een drukregelaarklep. De verdamper moet worden aangesloten op een vacuümleiding om de organische oplosmiddelen te verwijderen. Stel de rotatiesnelheid in op 100 tpm en het vacuüm op 0,5 atm en laat los als emulsieschuimvorming er overdreven uitziet. Nadat een gel zich vormt en verdwijnt, verhoogt u het vacuüm tot 0,9 atm.OPMERKING: Tijdens het verwijderen van vluchtige organische fasen moet het vacuümniveau geleidelijk worden aangepast om snel schuimen te voorkomen, omdat dit kan leiden tot inhoudsverlies van de injectieflacon in het lichaam van de roterende verdamper. Uiteindelijk, wanneer de ether en chloroform gedeeltelijk verdampen en de volumeverhouding tussen waterige en organische oplosmiddelfase dicht bij 1: 1 ligt, zal zich een gel vormen. De verdamping moet doorgaan totdat de gel verdwijnt en de resterende waterige media weer volledig vloeibaar zijn. Extra menging kan helpen de verwijdering van organische oplosmiddelen te versnellen. Dit kan worden bereikt door een polytetrafluorethyleenroerstaaf in de verdampingskolf te plaatsen om de convectie van de viskeuze gel tijdens roterende verdamping te verbeteren. Filter de resulterende liposomen met behulp van rups-geëtste polycarbonaatmembranen om een homogene grootteverdeling te bereiken.Voer filtratie uit door de liposoom waterige dispersie meerdere keren heen en weer te laten gaan door een polycarbonaatfilter met 200 nm-poriën in een liposoomextruder uitgerust met twee gasdichte spuiten.OPMERKING: Kleinere spuiten hebben de voorkeur (bijv. 0,5 ml) omdat ze zorgen voor het genereren van voldoende druk voor filtratie. Met een hoog cholesterolgehalte in het liposoommembraan is een hoge temperatuur niet nodig en kan de procedure bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Een oneven aantal filtraties (bijv. 21) wordt uitgevoerd, zodat het resulterende materiaal vanaf het begin aan de andere kant van het filter terechtkomt en als het vooraf wordt gesteriliseerd, kan het steriele monster van gefilterde grootte aangepaste liposomen worden verzameld. De grootte van de resulterende liposomen ligt meestal dicht bij de geselecteerde filterporiegrootte. Twee filters kunnen worden gestapeld (in plaats van één) om fijnafstelling uit te voeren naar een lagere deeltjesgrootte. Controleer de grootteverdeling met behulp van dynamische laserlichtverstrooiing (DLS)3,4.Voeg 1 tot 3 ml zoutoplossing toe aan een cuvette van 1 cm met vier transparante zijkanten. Voeg daar 10-01220 μL liposomen aan toe en meng voorzichtig. Plaats het monster in het apparaat en selecteer de volgende parameters om te meten: oplosmiddelviscositeit, brekingsindex, brekingsindex van lipiden. Klik op de knop Start . De metingen duren enkele minuten en bestaan uit 100 of meer runs. Verwijder extern Ca-acetaat met behulp van een ontzoutende spinkolom. Voeg aan de helft van de batch waterige tesaglitazar toe in een HEPES-buffer van 10 mM (pH 7,4) en incubeer met mengen bij 37 °C gedurende 1 uur. Gebruik de tweede helft van de batch als een medicijnvrije controle liposoom formulering.OPMERKING: Breng de 2 ml ontzoutende spinkolom vooraf in evenwicht met 10 mM HEPES-buffer, pH 7,4, vóór gebruik. Om dit te doen, plaatst u 1 ml HEPES-buffer in de kolom en draait u gedurende 2 minuten in een centrifuge op 1000 x g . Verwijder de pass-through buffer en herhaal dit vier keer. Verwijder niet-ingesloten tesaglitazar uit liposomen met behulp van een spinkolom van 2 ml en bepaal de concentratie van ingesloten geneesmiddelspectrofotometrisch. Voeg niet meer dan 0,5 ml liposoommonster toe aan het droge kolomgelbed en wacht tot al het monster de gel binnenkomt. Centrifugeer onder precies dezelfde omstandigheden als eerder (1000 x g, 2 min) en verzamel het liposoommonster in de pass-through gezuiverd van kleine moleculaire massaverbindingen. Kwantificeren van de uiteindelijke deeltjeskenmerken: deeltjesgrootte en -concentratie met behulp van DLS en zetapotentiaal met een gecombineerd DLS-elektroforetisch lichtverstrooiingssysteem (ELS) 3,4 in 10 mM HEPES-buffer pH 7,4 en bij 25 °C.Net als bij stap 1.5.2, verdun liposoomdispersie in de meetbuffer (bijv. 10 μL liposomen per 1 ml bufferoplossing) in een U-vormige cuvette met behulp van een wegwerp Luer-spuit of een pipet met een snijpunt. Zorg ervoor dat er geen bellen in de “U” zijn, zodat er een ononderbroken oplossing is voor elektrische stroom. Plaats de cuvette in het apparaat (let op de voor- en achterkant van de cuvette, zodat de elektroden goed op het apparaat zijn aangesloten). Sluit de instrumentdeur; Hierna vindt de meting plaats (met meerdere herhalingen), onder controle van de geleidingssoftware. 2. Bereid liposomen voor voor in vivo toediening Verdun in een bioveiligheidskast liposomen in steriele zoutoplossing tot de juiste concentratie in een eindvolume van 50 μL voor in vivo toediening.OPMERKING: In eerdere studies bevatte ons liposoompreparaat 2 mg / ml tesaglitazar, wat overeenkomt met ongeveer 4,89 μmol tesaglitazar / ml, en we dienden liposomen toe in een dosis van 1 μmol geneesmiddel / kg. Voor een muis van 40 g zouden we 8,2 μL liposomen tot een eindvolume van 50 μL in zoutoplossing brengen. Met behulp van DLS/ELS moet het aantal liposomen per volume-eenheid ook worden gekwantificeerd voor preparaten van met geneesmiddelen en voertuigen geladen liposomen om ervoor te zorgen dat een gelijk aantal voertuigliposomen per gram muisgewicht wordt toegediend in vergelijking met de liposomen met geneesmiddelen. Laad de liposoomoplossing in een naald van 27 G in de bioveiligheidskast. Bewaar dit op kamertemperatuur om te voorkomen dat koude oplossing in de muis wordt geïnjecteerd. 3. Dien liposomen toe via retro-orbitale intraveneuze injectie OPMERKING: Het is ook aangewezen om de intraveneuze injectie uit te voeren met andere methoden, zoals staartaderinjecties als dit de voorkeur heeft. Hoewel niet behandeld in dit protocol, zijn er gepubliceerde protocollen beschikbaar waarin deze methodewordt uitgelegd. Stel de werkruimte in voor het leveren van liposomen.Reinig de werkbank met 70% ethanol. Zorg ervoor dat u een ruimte selecteert die het gebruik van een isofluraan anesthesiesysteem toestaat. Zet een warming-pad aan en leg er een schoon maandverband of handdoek overheen om de muis op een schoon oppervlak te houden. Geef de pad voldoende tijd om op te warmen voordat u met muizen begint te werken. Stel het anesthesiesysteem zo in dat de kamer in de buurt is en de neuskegel zich op het verwarmingskussen bevindt.Zorg ervoor dat alle andere aspecten van het systeem klaar zijn (bijvoorbeeld, het isofluraanniveau is hoog genoeg in de verdamper, het houtskoolfilter is gewogen, de slang is correct aangesloten). Verzamel de andere materialen die nodig zijn voor dit gedeelte van het protocol: oogheelkundige glijmiddelgel, een lokaal verdovingsmiddel voor nabehandeling, steriele gaasjes. Verdoof de muis met isofluraan in de inductiekamer. Zodra het niet meer reageert op een zachte voettik, brengt u de muis snel over naar de werkruimte terwijl u de sedatie door een neuskegel behoudt.OPMERKING: Het dier moet op 1,5% tot 2,5% isofluraan worden gehouden en worden beoordeeld op een geschikte diepte van anesthesie (via een gebrek aan respons op teenknijpen) voordat de procedure wordt voortgezet. Verplaats de muis naar één kant voor liposoomtoediening. Omdat de muis niet zal knipperen tijdens het verdoven, brengt u een kleine hoeveelheid oogheelkundig glijmiddel aan op beide ogen om ze gehydrateerd te houden tijdens de rest van de procedure. Druk zachtjes op de huid boven en onder het blootgestelde oog. Het oog moet boven het vlak van het gezicht uitstijgen. Steek voorzichtig de punt van de naald bij de mediale canthus, zorg ervoor dat de naald zich onder het oog bevindt en raak deze niet aan. Zodra de naald onder het oog is ingebracht, injecteert u de liposomen langzaam in de retro-orbitale ruimte. Bij het terugtrekken van de naald kan het nodig zijn om de oogleden een paar seconden te sluiten om hemostase te bereiken.Als de naald niet ver genoeg wordt ingebracht, kan de oplossing rond het oog ontstaan. Stop onmiddellijk met injecteren als dit wordt gezien en plaats de naald opnieuw. Breng een lokaal verdovingsmiddel, zoals proparacaïne, aan op het oog om pijn en ongemak na de procedure te voorkomen. Houd de muis op een opwarmkussen en controleer totdat deze ontwaakt om ervoor te zorgen dat hij goed is en de juiste lichaamstemperatuur behoudt. Breng de muis terug naar zijn kooi en zijn normale woonomgeving totdat het moment van interesse arriveert.OPMERKING: Dit moet worden gedaan in overeenstemming met de lokale IACUC-richtlijnen. 4. Bereid materialen voor op de weefseloogst, weefselverwerking en flowcytometriekleuring Bereid oplossingen voor de oogst, verwerking en kleuring (secties 5\u20127): fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-Heparine, HEPES Buffer, 2 mg/ml Collagenase type I, AKC lysis buffer, FACS buffer, PBS, Fixatie buffer (Tabel 2). Houd alle oplossingen behalve de fixatiebuffer op 4 °C of op ijs tijdens de procedure. Bereid buizen voor met buffers en andere materialen voor het oogsten en verwerken van weefsels.Voeg voor bloed van elke muis 10 μL 0,5 M EDTA toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml voor het verzamelen van het bloed. De EDTA voorkomt dat het bloed stolt. Een spuit van 1 ml met een naald van 25 G en een conische buis van 15 ml zijn ook nodig. Verzamel voor de milt één microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml met 1 ml HEPES-buffer, een spuit van 1 ml, twee conische buizen van 50 ml en twee filters van 70 μm per milt. Verzamel voor elk vetweefseldepot een polyethyleen injectieflacon van 20 ml met 1,5 ml HEPES-buffer voor het fijnhakken van het weefsel, een conische buis van 50 ml en een filter van 70 μm per vetweefseltype per muis. Bereid de werkruimte voor op de oogst.Reinig de bankruimte met 70% ethanol. Maak een rubberen bakje klaar voor het vastzetten van de muis tijdens de oogst door hem schoon te maken met 70% ethanol en af te dekken met een absorberend kussen of papieren handdoeken. Zorg ervoor dat er minstens 5 pinnen beschikbaar zijn om mee te werken. Vul een spuit van 10 ml met PBS-heparine en bevestig deze op een naald van 25 G voor perfusie. Verzamel gereedschappen en materialen om te gebruiken tijdens de oogst. Tangen (twee paar), scharen, papieren handdoeken, pluisvrije doekjes, de microcentrifugebuis(en) met EDTA, de microcentrifugebuis(en) met HEPES-buffer en de polyethyleen injectieflacon(s) met HEPES-buffer zijn nodig. 5. Oogst de weefsels Euthanaseer de muis door CO 2-verstikking. Voer geen cervicale dislocatie uit, omdat dit effectieve bloedafname en weefselperfusie in latere stappen kan voorkomen. Op een schoongemaakte bank met voldoende werkruimte en verlichting om de muis goed te zien, plaatst u een rubberen snijbak, een emmer ijs voor het opslaan van monsters en een spuitfles met 70% ethanol. Spray de muis in met 70% ethanol om vervuiling te verminderen en de verspreiding van het haar onder controle te houden. Plaats de muis op zijn rug op de rubberen bak en pin zijn poten gespreid weg van zijn lichaam. Om je voor te bereiden op het verzamelen van bloed, maak je voorzichtig een incisie in de huid aan de rand van het caudale uiteinde van de ribbenkast van de muis. Knip een kleine, rechte lijn omhoog naar de kop van de muis (ongeveer 1 cm) totdat de borstspieren bloot komen te liggen.Maak op de eerste incisieplaats twee kleine sneden loodrecht op de lijn naar het hoofd. Snijd vervolgens voorzichtig de borstspier aan één kant van de ribbenkast in het blootgestelde gebied weg. Dit zorgt voor een betere toegang en visualisatie van waar de naald moet worden ingebracht. Om bloed te verzamelen, steekt u de naald tussen de derde en vierde ribben aan de kant waar de spier is verwijderd. Omdat het hart van de muis zich in het midden van de borstholte bevindt, moet u de naald zo dicht mogelijk bij de middellijn van de ribbenkast houden. Eenmaal ingebracht, trekt u voorzichtig aan de spuit om te beginnen met het verzamelen van bloed. Eenmaal verzameld, breng het bloed over naar de voorbereide microcentrifugebuis met EDTA en bewaar op ijs.OPMERKING: Als ongeveer 100 μL volume wordt opgetrokken en er geen bloed in de spuit komt, probeer dan de spuit naar rechts of links te draaien voor het geval de naaldopening tegen de wand van het hart wordt gedrukt. Als dit niet helpt, beweeg de naald dan langzaam verder in de borstholte of begin met verwijderen. Als het bloed zich op dit punt in de spuit begint te verzamelen, blijft u de spuit langzaam terugtrekken. Overweeg om de spuit en naald te draaien voor een succesvolle extractie. Ten slotte, als er geen bloed wordt verzameld, verwijdert u de naald omdat deze mogelijk het hart heeft gemist. Probeer de naald opnieuw in te brengen en het bovengenoemde proces opnieuw te herhalen. Vervolgens, om de muis te doordrenken, opent u de borstholte om toegang te krijgen tot het hart.Om dit te doen, snijdt u de huid langs het uiteinde van de ribbenkast aan elke kant naar de kant van de muis. Gebruik vervolgens de tang om het borstbeen weg te houden van het werkoppervlak. Maak een kleine, ondiepe incisie net onder het uiteinde van het borstbeen om door de peritoneale holte te snijden. Snijd langs het peritoneale membraan langs het uiteinde van de ribbenkast aan elk van de zijkanten van de muis. Dit moet de lever en galblaas blootleggen. Pas op dat u niet in een van deze weefsels snijdt. Maak vervolgens een kleine, ondiepe snede in het middenrif, craniaal naar de lever. Snijd vervolgens het middenrif langs de rand van de ribbenkast om de borstholte te openen. Zorg ervoor dat u geen van de organen in de borstholte snijdt. Maak twee sneden langs de ribbenkast naar het hoofd op ongeveer 2-3 mm van de middellijn van de muis en ongeveer 0,75 cm lang.OPMERKING: Als ze te hoog worden gesneden, worden de slagaders aan de bovenkant van de ribbenkast doorgesneden. Dit zal de werkzaamheid van perfusie verstoren. Til het middelste stuk van de ribbenkast terug om de borstholte bloot te leggen. Verplaats vet of weefsel weg om toegang te krijgen tot het hart. Maak een kleine snee in het rechteratrium van het hart van de muis om een opening te maken waardoor het bloed naar buiten kan worden geduwd. Gebruik een spuit van 10 ml PBS-heparine om de naald in de linkerkamer van het hart van de muis te steken. Begin voorzichtig PBS zo langzaam mogelijk in het hart te duwen.OPMERKING: Er moet bloed worden waargenomen dat uit de rechterboezems komt en de borstholte vult. Zorg ervoor dat u het hart op zijn fysiologische locatie houdt om te voorkomen dat de stroom van PBS-heparine van het hart door de aorta wordt geremd. Zodra alle 10 ml PBS-heparine door de muis is geperfuseerd, gooit u de spuit en naald weg en verwijdert u overtollig bloed en PBS-heparine uit de borstholte met behulp van papieren handdoeken of pluisvrije doekjes. Om vervolgens te beginnen met het extraheren van weefsels, snijdt u de huid en het peritoneale membraan naar de staart van de muis om de peritoneale holte te openen. Haal eerst het inguinale vetweefselkussen uit elke kant van de muis.OPMERKING: Lees dit proces zorgvuldig door: zorg ervoor dat u de inguinale lymfeklier uit elk depot haalt om te voorkomen dat de cellulaire samenstelling van het vetweefsel in de resultaten scheeftrekt.Houd met behulp van een tweede set tangen het peritoneale membraan vast met één set tangen en de rand van de huid bedekt boven het membraan aan die kant met de andere tang. Trek de huid voorzichtig weg van het peritoneale membraan om deze lagen van elkaar te scheiden. Zoek naar het inguinale vetweefseldepot langs de huid. Pin de buitenrand van de huid vast om beter toegang te krijgen tot het vetdepot. Lokaliseer voorafgaand aan de extractie de inguinale lymfeklier in het midden van het vetdepot en verwijder deze indien nodig met een tang en een schaar.OPMERKING: Zoek indien mogelijk de drie grotere slagaders die van de buitenranden van het depot naar het midden lopen. De lymfeklier bevindt zich rond waar deze slagaders samenkomen. Nadat de lymfeklier is verwijderd, houdt u voorzichtig het uiteinde van het vetdepot het dichtst bij het vastgepinde punt met de tang en begint u kleine sneetjes te maken bij het bindmembraan tussen het vetweefsel en de huid. Til het vetweefsel weg van de huid terwijl u snijwonden maakt om betere toegang tot het membraan te krijgen en ervoor te zorgen dat het hele depot wordt geëxtraheerd. Plaats het vetdepot in een voorbereide polyethyleen injectieflacon met HEPES-buffer op ijs om het weefsel levensvatbaar te houden tijdens de rest van de oogst. Herhaal dit proces aan de andere kant van de muis om beide depots te extraheren. Depots kunnen samen of afzonderlijk worden verteerd en verwerkt. Als elk depot afzonderlijk moet worden verwerkt, moeten er meer buizen worden voorbereid. Haal vervolgens de epididymale vetdepots uit het caudale uiteinde van de peritoneale holte. Trek met een tang voorzichtig het eerste epididymale vetdepot weg van het dorsale uiteinde van de muis en lokaliseer de bijbal en zaadleider die aan dit depot zijn bevestigd.OPMERKING: Er zijn twee epididymale vetdepots: één bevestigd aan elke bijbal en zaadleider.Snijd voorzichtig tussen het vetdepot en de bijbal en zaadleider om het vet van deze andere weefsels te scheiden. Plaats het vetdepot in een polyethyleen injectieflacon met HEPES-buffer op ijs om het weefsel levensvatbaar te houden tijdens de rest van de oogst. Extraheer ten slotte de milt, die zich links van de maag in de buurt van het middenrif bevindt. Trek met een tang de maag voorzichtig naar het midden van de peritoneale holte om de milt bloot te leggen.Houd het ene uiteinde van de milt voorzichtig vast en trek het iets weg van de maag. Snijd het membraan tussen de milt en het aangrenzende weefsel totdat het orgaan is losgemaakt. Plaats de milt in de voorbereide microcentrifugebuis met HEPES-buffer en bewaar op ijs. Voordat u tissues verwerkt of tissues van de volgende muis oogst, gooit u het karkas en eventuele bevuilde papieren handdoeken of pads weg. Veeg ook gereedschappen af.OPMERKING: Als er meerdere muizen zijn, herhaalt u deze oogststappen voor elke muis voordat u doorgaat naar de volgende verwerkingsstap. Als een controlemuis /muizen is opgenomen, overweeg dan om deze te oogsten voorafgaand aan met liposomen behandelde muizen om besmetting te voorkomen. 6. Procesweefsels OPMERKING: Aangezien het vetweefsel een lange incubatie van de spijsvertering heeft, wordt aanbevolen om eerst met dat proces te beginnen en te werken aan het verwerken van het bloed en de milt tijdens de verteringsperiode. Hak eerst het vetweefsel fijn en verteer het. Gebruik een of twee schaartjes om het vetweefsel in elke polyethyleen injectieflacon te hakken totdat het weefsel in kleine stukjes van minder dan 0,5 mm groot is. Dit zorgt voor een efficiëntere vertering.Zodra de weefsels in alle injectieflacons zijn gehakt, voegt u 1,5 ml collagenasebuffer toe aan elke injectieflacon. Plaats de injectieflacons in een schudincubator die is ingesteld op 37 °C en 150 tpm. Incubeer gedurende 30 tot 45 min.OPMERKING: Als de vetweefsels bijzonder groot zijn, overweeg dan om nog eens 0,5 ml tot 1,5 ml HEPES-buffer en een gelijk volume collagenasebuffer aan de injectieflacon (s) toe te voegen om ervoor te zorgen dat weefsels volledig ondergedompeld zijn en voldoende enzym aanwezig is. De uiteindelijke concentratie collagenase type I bij de spijsvertering moet 1 mg/ml zijn, ongeacht het uiteindelijke volume van de oplossing. Bovendien kunnen, als er geen schudincubator beschikbaar is, monsters in een waterbad worden geplaatst dat wordt verwarmd tot 37 °C. Schud de monsters voorzichtig om de 5 minuten om de spijsvertering te mengen en opnieuw te suspenderen. Controleer de monsters op 30 min. Gebruik een pipet van 1 ml om het monster op en neer te pijpen. Als de weefselstukken nog steeds te groot zijn om gemakkelijk te pipetteren, breng de monsters dan nog eens 15 minuten terug naar de couveuse. Zodra de monsters volledig zijn verteerd, blijft u het monster nog eens 10 keer op en neer pipetten om ervoor te zorgen dat er een eencellige suspensie is gemaakt.OPMERKING: (Optioneel) Controleer de monsters op 30 min. Gebruik een pipet van 1 ml om het monster op en neer te pijpen. Als de weefselstukken nog steeds te groot zijn om gemakkelijk te pipetteren, breng de monsters dan nog eens 15 minuten terug naar de couveuse. Pipetteer de celsuspensie door een filter van 70 μm in een conische buis van 50 ml. Voeg 5 ml FACS-buffer toe aan de lege injectieflacon om de injectieflacon uit te spoelen. Breng deze wasbuffer door het filter om toe te voegen aan de celsuspensie. Bewaar monsters op ijs terwijl andere worden verwerkt. Zodra alle monsters zijn gefilterd, draait u ze gedurende 5 minuten op 400 x g, 4 °C. Verwijder het adipocytensupernatant door aspiratie en verwijder vervolgens voorzichtig het infranatant tussen het adipocytensupernatant en de pellet door aspiratie om de stromaal-vasculaire fractie (SVF) pellet te verlaten. Resuspendeer deze pellet in 1 ml FACS-buffer en breng over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml. Aliquote cellen nu indien gewenst of nodig. Blijf op ijs totdat alle monsters klaar zijn voor flowcytometriekleuring.OPMERKING: Als de verteerde vetdepots groot waren, overweeg dan om slechts 50% of 25% van het monster te gebruiken voor flowcytometrische kleuring en analyse. Bovendien, als fluorescentie-minus-één (FMO) controles of aanvullende controles voor flowcytometrie-analyse (tabel 1) nodig zijn, zorg er dan voor dat u extra monster in een aparte buis plaatst voor verwerking. FMO’s worden gebruikt om onderscheid te maken tussen negatief en positief signaal voor een individueel fluorofoor-geconjugeerd antilichaam binnen het anders complete panel dat in het experiment wordt gebruikt. Ten tweede, verwerk het bloed.Breng 50 μL bloed over in een conische buis van 15 ml. Voeg 1 ml AKC-lysisbuffer toe aan elke buis en pipet op en neer om een eencellige suspensie te bereiken. Voeg een extra 4 ml AKC-lysisbuffer toe aan elke buis en incubeer gedurende 5-01210 minuten. Als er een shaker of rotator beschikbaar is, sluit u de buisdoppen goed af en plaatst u de buizen op een van deze om het mengen te verbeteren. Voeg 5 ml FACS-buffer toe om het lysisproces te blussen en draai de monsters gedurende 5 minuten op 400 x g, 4 °C. Verwijder het supernatant en controleer de pellet. Als het nog steeds vrij rood is, herhaal dan het lysisproces. Anders resuspendeert u de pellets in 1 ml FACS-buffer en brengt u over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml. Blijf op ijs totdat alle monsters klaar zijn voor flowcytometriekleuring. Verwerk ten slotte de milt. Breng de milt over op een filter van 70 μm over een conische buis van 50 ml. Was het weefsel met 1 ml FACS-buffer en pureer vervolgens de milt door het filter met behulp van het zuigeruiteinde van een spuit van 1 ml. Was tijdens het maischproces de cellen in de conische buis van 50 ml met behulp van meer FACS-buffer. Het uiteindelijke volume in de conische buis moet 10 ml zijn.Draai de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspensie in 1 ml AKC-lysisbuffer. Voeg een extra 4 ml AKC-lysisbuffer toe en incubeer gedurende 5 minuten. Voeg 5 ml FACS-buffer toe om het lysisproces te blussen en draai de monsters gedurende 5 minuten op 300 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 1 ml FACS-buffer. Breng de suspensie door een tweede, schoon filter van 70 μm over in een conische buis van 50 ml. Voeg 4 ml FACS-buffer toe om de originele buis uit te spoelen en breng de buffer door het filter over voor een eindvolume van 5 ml. Breng 50 μL van de celsuspensie over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 of 1,7 ml en blijf op ijs totdat alle monsters klaar zijn voor flowcytometriekleuring. Extra aliquots kunnen worden overgebracht naar buizen als er meer gewenst of nodig zijn.OPMERKING: Splenocyten zijn uitstekende cellen om te gebruiken voor een levende / dode enkele vlek. Overweeg een extra aliquot over te dragen voor dit besturingselement. 7. Kleurcellen uit weefsels voor flowcytometrie Spin genoteerde monsters af bij 400 x g, 4 °C gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspensie van monsters in 50 μL Fc Block (verdund) (tabel 2). Incubeer op ijs gedurende 5 min. Voeg 50 μL 2x antilichaammengsel (tabel 3) toe aan elk monster. Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten.OPMERKING: Eventuele enkele vlekken mogen NIET worden gekleurd met deze antilichaammix. Als FMO’s moeten worden gebruikt, moeten FMO-antilichaammengsels bovendien afzonderlijk worden bereid. Was monsters met 1 ml PBS en draai op 400 x g, 4 °C gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspensie van de monsters in 200 μl levensvatbaarheidsvlek (tabel 3). Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten.OPMERKING: Vergeet niet om cellen te kleuren die tijdens deze stap zijn gereserveerd voor een Live / Dead enkele vlek. Was monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 400 x g, 4 °C. Verwijder supernatant en resuspensie van monsters (behalve levende/dode enkele vlek) in 50 μl fixatiemedium (reagens A) om monsters te fixeren. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 min.Resuspendeer de Live/Dead enkele vlek in 100 μL van 2% PFA. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 5 min. Was het monster met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g, 4 °C. Verwijder supernatant en resuspensie van monsters in 250 tot 500 μL FACS-buffer. Bewaren bij 4 °C totdat monsters op de flowcytometer kunnen worden uitgevoerd. Was monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g, 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie monsters in 50 μL permeabilisatiemedium (reagens B) plus antilichaam(en) tegen intracellulaire eiwitten. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten. Was de monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie van de monsters in 100 μL 2% paraformaldehyde (PFA). Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 5 min. Was monsters met 1 ml FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten op 800 x g, 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspensie van de monsters in 250 tot 500 μL FACS-buffer. Bewaren bij 4 °C totdat monsters op de flowcytometer kunnen worden uitgevoerd.