Screening spettrofotometrico per potenziali inibitori di Glutathione Cytosolic S-Transferases
Summary
Glutathione S-transferases (GSTs) sono enzimi di disintossicazione coinvolti nel metabolismo di numerosi farmaci chemioterapici. La sovraespressione delle GST è correlata alla resistenza alla chemioterapia del cancro. Un modo per contrastare questo fenotipo è quello di utilizzare inibitori. Questo protocollo descrive un metodo che utilizza un saggio spettrofotometrico per cercare potenziali inibitori della GST.
Abstract
Glutathione S-transferases (GSTs) sono enzimi metabolici responsabili dell’eliminazione di composti elettrofili endogeni o esogeni dalla coniugazione del glutathione (GSH). Inoltre, i GST sono regolatori delle chinasi proteiche (MAPK) attivate da mitogeni coinvolti in percorsi apoptotici. La sovraespressione delle GS È correlata alla diminuzione dell’efficacia terapeutica tra i pazienti sottoposti a chemioterapia con agenti elettrofili alchilanti. L’uso di inibitori GST può essere una potenziale soluzione per invertire questa tendenza e aumentare la potenza di trattamento. Il raggiungimento di questo obiettivo richiede la scoperta di tali composti, con un saggio enzimatico accurato, rapido e facile. Un protocollo spettrofotometrico che utilizza 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) come il substrato è il metodo più impiegato nella letteratura. Tuttavia, gli esperimenti di inibizione GST già descritti non forniscono un protocollo che dettaglia ogni fase di un saggio di inibizione ottimale, come la misurazione della costante Michaelis-Menten (K m )perCDNB o l’indicazione della concentrazione di enzimi impiegati, parametri cruciali per valutare la potenza di inibizione di un composto testato. Quindi, con questo protocollo, descriviamo ogni fase di un saggio ottimizzato dell’enzima SPECtrofotometrico GST, per screening delle librerie di potenziali inibitori. Spieghiamo il calcolo sia della concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) che della costantedi inibizione(K i), due caratteristiche utilizzate per misurare la potenza di un inibitore enzimatico. Il metodo descritto può essere implementato utilizzando un pool di GST estratti da celle o GST umani ricombinanti puri, vale a dire GST alfa 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) o GST pi 1 (GSTP1). Tuttavia, questo protocollo non può essere applicato all’IMPOSTA GST 1 (GSTT1), in quanto LA CDNB non è un substrato per questo isoforme. Questo metodo è stato utilizzato per testare la potenza di inibizione della curcumina utilizzando GST da fegato equino. Curcumina è una molecola che esibisce proprietà anti-cancro e ha mostrato affinità verso isoformi GST dopo in previsioni di attracco silico. Abbiamo dimostrato che la curcumina è un potente inibitore competitivo della GST, con un IC50 di 31,6 ± 3,6 M e un Ki di 23,2 ± 3,2 M. La curcumina ha il potenziale per essere combinata con farmaci chemioterapici elettrofili per migliorarne l’efficacia.
Introduction
Gli enzimi di glutathione citosolico (GSTs, EC 2.5.1.18) catalizzano la coniugazione del glutathione (GSH) in vari composti elettrofili, come gli agenti chemioterapici, per disintossicarli ed eliminarli facilmente dal corpo1. Sette isoformi di GST citosolico sono stati identificati come alfa, mu, pi, sigma, omega, theta e zeta. Le GST sono espresse principalmente nel fegato, nei testiti, nei polmoni e nel tratto gastrointestinale2. L’isoforme GST alfa 1 (GSTA1) è altamente espresso in epariti. Il corpo esprime eterogeneamente altri sottotipi, tra cui GST pi 1 (GSTP1) prevalentemente nel cervello, cuore e polmoni, e GST mu 1 (GSTM1) nel fegato e teste3. Anche se c’è un’alta sequenza di omologia tra isoformi GST, ognuno presenta specificità del substrato ed è implicato nel metabolismo dei farmaci e nel cancro in modi diversi, secondo la sua espressione differenziale4,5.
I composti elettrofili entrano nel corpo esogenamente o sono prodotti in modo endogeno. Pesticidi, prostaglandine, cancerogeni e farmaci chemioterapici sono alcuni dei potenziali substrati per le reazioni coniugazione glutathione6. Ad esempio, qualsiasi composto reattivo carente di elettroni formato all’interno di una cellula rischia di diventare un substrato elettrofilo. Agenti di alchilating come il cloroambucil o melphalan sono eliminati come coniugati di GSH catalizzato da GSTs, e l’aumento dei livelli di questi enzimi sono stati correlati con la resistenza a questi composti6,7.
Un altro importante ruolo dei GST citosolici è la regolazione dell’attività delle chinasi proteiche attivate da mitogeni (MAPK) come MAPK8 (noto anche come c-Jun N-terminal kinase, o JNK1) e MAP3K5 (noto anche come chinasi 1 che regola il segnale di apoptosi o ASK1)8. Alcune isoformi nella loro conformazione monomeccatica si legheranno a queste proteine e quindi bloccherà la cascata di fosforilazione. In condizioni normali, l’isoforme GSTP1 sequestrerà MAPK8 (l’attivatore della proteina c-Jun). La combinazione del c-Jun con la proteina c-Fos forma il fattore di trascrizione della proteina attivatore 1 (AP-1), responsabile della trascrizione dei geni pro-apoptotici. Nelle cellule stressate, il complesso formato da GSTP1 e MAPK8 si dissocia, c-Jun viene attivato e i geni che portano all’apoptosi iniziano ad essere espressi9. Una maggiore espressione di questo isoforme GST potrebbe quindi bloccare il percorso, portando ad una maggiore vitalità cellulare, più proliferazione cellulare e minore sensibilità cellulare alla chemioterapia. Scenari simili possono verificarsi con i paralogi di GSTP1, ad esempio GSTM1, che interagisce con MAP3K510.
I ruoli svolto dai GS Nel metabolismo dei farmaci e nel sequestro dei MAPK hanno portato all’ipotesi che una maggiore espressione dei GST potesse essere un segno di un meccanismo di resistenza tumorale al trattamento chemioterapico6,11. Ad esempio, GSTP1 è sovraespresso in numerosi tumori e la sua presenza è stata correlata con una prognosi infausta e una maggiore incidenza di ricaduta8. Il polimorfismo in questi geni ha anche mostrato tassi differenziali di esposizione ai farmaci e sopravvivenza per i pazienti che presentano varie malattie, rafforzando l’idea che questi enzimi siano cruciali per i meccanismi di resistenza ai farmaci. Ad esempio, gli individui con il genotipo null GSTM1 sono associati a una minore clearance di droga e a unamigliore sopravvivenza 12,13. Esistono diversi potenziali mezzi per contrastare questa sovraespressione, come l’uso di analoghi GSH, prodrughe che vengono attivate mediante coniugazione con GST o inibitori gstdiretti 14,15.
Tutti questi metodi sono attualmente in fase di studio, e alcuni composti hanno iniziato studi clinici per il loro potenziale utilizzo tra i pazienti. Tuttavia, per quanto ne so, non ci sono composti in uso come inibitori GST in ambienti clinici15. Infatti, la mancanza di specificità per alcuni isoformi o l’esaurimento della GSH nelle cellule normali, che possono portare a tossicità causate dall’accumulo di specie reattive di ossigeno (ROS) nei sistemi di organi, sono solo alcuni degli inconvenienti che riducono il potenziale degli inibitori GST14,15. Il rischio che questi composti potrebbero esercitare altri effetti farmacodinamici sul corpo stanno anche limitando il loro utilizzo. L’acido etacrinico, ad esempio, è l’inibitore GST più ampiamente studiato negli ambienti di laboratorio, ma poiché viene utilizzato principalmente come un forte diuretico, questa proprietà ne limita l’uso in combinazione con altri farmaci in ambienti clinici. Curcumina è un altro composto naturale proiettato con successo come un inibitore GST. Questa molecola è un etere polifenolo estratto dalla specie di curcuma longa curcuma. Ha mostrato risultati promettenti come possibile opzione di trattamento contro il cancro inducendo l’apoptosi di vari tipi di linee cellulari tumorali16,17. Il composto può regolare diversi percorsi cellulari, come la chinasi tirosina18 o il percorso GST. Studi con proteine pure hanno dimostrato la sua potenza di inibizione su GSTA1, GSTM1 e GSTP119,20. Tuttavia, sono stati osservati risultati contrastanti nelle cellule tumorali, dove è stata misurata una maggiore attività DI GST intracellulare quando le cellule sono state trattate con lacurcumina 21. Pertanto, è importante studiare la concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) e la costante diinibizione(K i ) di qualsiasi inibitore di GST putativo utilizzando un protocollo chiaramente descritto con controlli adeguati prima di pianificare ulteriori esperimenti cellulari.
Lo screening e il test di potenziali nuovi inibitori della GST sono quindi di notevole interesse clinico e qualsiasi nuovo composto trovato deve essere sicuro ed efficiente per l’uso in combinazione con farmaci elettrofili. Concentrare la ricerca sugli inibitori specifici dell’isoformi potrebbe consentire l’inibizione della GST nei tessuti tumorali che presentano modelli specifici di espressione GST, consentendo così lo sviluppo di una terapia di combinazione efficace. Trovare inibitori con modalità differenziali di inibizione potrebbe anche essere di interesse. Ad esempio, un inibitore competitivo che utilizza GSH come substrato può indurre il suo esaurimento. Questa riduzione della concentrazione di GSH nelle cellule è stato indicato per indurre lo stress ossidativo nei neuroni, che porta all’apoptosi. Un’altra modalità comune di inibizione, l’inibizione non conditiva, non può essere invertita anche se il substrato è presente in alte concentrazioni.
La velocità di attività ezimatica è rappresentata dalla costante Michaelis-Menten (Km) e dalla velocità massima (Vmax), che può essere determinata tracciando un grafico Michaelis-Menten, con la concentrazione del substrato rispetto alla velocità della reazione23. Km è la concentrazione di substrato necessaria per occupare metà dei siti attivi ezimatici, il che significa che un alto Km rappresentano meno affinità. Vmax rappresenta la velocità massima della reazione, raggiunta quando tutti i siti attivi sono occupati dal substrato. Km è uguale a metà Vmax. Esistono tre modalità di inibizione più comuni: competitiva, non competitiva e non competitiva. In caso di inibizione competitiva, l’inibitore si lega al sito attivo dell’enzima e compete con il substrato. Quindi, Vmax non cambia dopo l’aggiunta dell’inibitore, ma Km aumenta, come più substrato è necessario per contrastare l’inibizione. L’inibizione non concompetitiva si verifica solo quando il substrato forma un complesso con l’enzima. In questo caso, poiché il livello di inibizione dipende dalla concentrazione di substrato edenzima, Vmax e K m diminuiscono quando l’inibitore viene aggiunto alla reazione. L’ultima modalità di inibizione è non competitiva ed è un mix degli altri due modelli di inibizione. L’inibitore può legarsi al sito attivo dell’enzima se l’enzima è legato al suo substrato o meno. Qui Vmax diminuisce dopo l’aggiunta dell’inibitore, ma Km non cambia24.
Un’analisi spettrofotometrica che misurava l’attività GST è stata sviluppata per la prima volta da Habig et al. nel 1974 utilizzando 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) come substrato per la reazione22. La coniugazione tra GSH e CDNB forma GS-DNB, che presenta un’assorbimento di luce massima alla lunghezza d’onda di 340 nm, registrabile con uno spettrofotometro. La maggior parte della tecnica spiegata di seguito è derivata da Habig et al., incluse informazioni sulle migliori impostazioni e importanti punti di ottimizzazione per un saggio inibitorio. La tecnica può essere applicata allo screening dei potenziali inibitori della GST, sia che si tratti di una selezione razionale di farmaci mediante previsioni computazionali o di revisione della letteratura. Viene inoltre discusso come adattare il protocollo alle proteine GST appena sintetizzate o alle isoformi specifiche. Ad esempio, testare la potenza inibitoria delle isoformi GST che presentano un polimorfismo clinicamente rilevante o di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) potrebbe essere un potenziale uso per questo protocollo, mirando a T PST specifici per i pazienti.
Questo protocollo fornisce un metodo rapido, fattibile ed efficace per lo screening di potenziali inibitori GST in vitro prima di qualsiasi altro studio funzionale. Sono descritti i passaggi necessari per valutare le caratteristiche più comunemente misurate di un inibitore enzimatico: la concentrazione inibitoria 50 (IC50) che è la concentrazione di inibitore necessaria per dimelare l’attività enzimatica; e la costante di inibizione (Ki) che rappresenta la costante di equilibrio della dissociazione tra l’inibitore e l’enzima, caratteristica dell’affinità tra queste due molecole. Questi due valori sono misurati dalla regressione non lineare e utilizzando equazioni specifiche per ogni modalità di inibizione, rispettivamente. Dimostriamo anche la valutazione di questo modello di inibizione, utilizzando trame Michaelis-Menten per determinare il cambiamento di Vmax e Km dopo l’aggiuntadell’inibitore 23,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forniamo un protocollo che descrive ogni fase di un saggio spectrofotometrico dell’enzima GST, per lo screening degli inibitori putativi (Figura 1, Tabella 1) e quantificarne la potenza inibitoria. Abbiamo anche sottolineato i criteri più cruciali da considerare per analisi enzimi accurate che forniscono risultati riproducibili. I principali vantaggi del protocollo descritto rispetto ad altri metodi colorimetrici o spettrometria di massa è che questo protocollo è rapido e facile da eseguire e fornire misurazioni quantitative dell’attività GST, nonché la potenza di inibizione delle molecole proiettate.
Vi presentiamo il modo di calcolare i due parametri Più importanti Michaelis-Menten di un inibitore enzimatico: l’IC50 e il Ki. Un potente inibitore eserciterà il più basso Ki e IC50, indicando che l’affinità tra l’inibitore e l’enzimaè alta 30. Poiché l’IC50 dipende dalla concentrazione degli enzimi e dalle condizioni di analisi33, può essere difficile utilizzare questo valore per confrontare gli inibitori di esperimenti diversi o ottenuti utilizzando altre condizioni di analisi34. Utilizzando la costante di inibizioneK i è un indicatore migliore della potenza inibitoria di composti potenziali. Ki può essere utilizzato per confrontare due inibitori con diversi modi di inibizione, in quanto si basa esclusivamente sull’affinità tra l’inibitore e l’enzima. Tuttavia, per avere un’idea chiara della natura dell’inibizione è necessario determinare entrambi i parametri dell’inibitore30. Abbiamo misurato curcumins’ IC50 e Ki come 31,6 ± 3,6 M e 23,2 ± 3,2 M, rispettivamente, indicando che questo composto è un potente inibitore GST. Questi risultati hanno confermato le previsioni in silico, che stimanoi valori di K i tra 27,4 e 78,1 M per diversi isoformi e curcumina gst umana.
Attività enzimatica o tasso di reazione e quantità di enzima
Come detto in precedenza, IC50 dipende dalla concentrazione di enzimi, e condurre un esperimento con un livello sconosciuto di attività enzimatica potrebbe portare a false conclusioni33. Per controllare altri fattori, che potrebbero ridurre l’attività inibitoria, si dovrebbe considerare e misurare l’attività enzimatica per ogni nuovo lotto di T PST. Ad esempio, la degradazione di un lotto ezimatico, causata da troppi cicli di congelamento/disgelo, potrebbe diminuire l’attività e quindi portare a un IC50 inferiore anche se l’esperimento è stato eseguito nelle stesse condizioni. In altre parole, l’utilizzo di 0,01 unità di enzima non darà gli stessi risultati dell’utilizzo di 1 unità. L’utilizzo di troppi enzimi potrebbe portare ad un rapido esaurimento del substrato e la reazione non avrà una forma lineare. Questo parametro potrebbe quindi portare a un risultato inesatto, in quanto nessun cambiamento di assorbimento si sarebbe visto dopo un lungo tempo di incubazione.
Km Valore
Per garantire le migliori condizioni per valutare il tipo di inibizione esibita da un inibitore, la concentrazione del substrato deve essere uguale o inferiore alla costante Michaelis-Menten (Km). Km è rappresentato dalla concentrazione di substrato necessaria per occupare metà dei siti attivi sull’enzima28. Ad esempio, una maggiore concentrazione di substrato può contrastare un inibitore competitivo e valutare questo tipo di inibizione sarà difficile in tale ambiente. Così, uno dei passaggi cruciali in questa metodologia è la determinazione del Km dell’enzima per il substrato selezionato (qui CDNB). In alcuni studi, questo valore non è stato determinato e questo potrebbe portare a false conclusioni sul modello di inibizione causato dall’inibitore e, se la modalità di inibizione non è corretta, il K i verrà calcolato in modo erratopoiché l’equazione si basa sul modello di inibizione26,28. Se viene testata un isoforme GST diverso, è obbligatoria una nuova valutazione del valore Km, in quanto questo valore è univoco per una coppia di enzimi e ligando. Poiché abbiamo usato una concentrazione di CDNB leggermente inferiore al Km (0,2 mM), che abbiamo definito come 0,26 ± 0,08 mM, la modalità competitiva prevista di inibizione della curcumina sulla GST è stata accuratamente determinata.
IC50
Ottenere una buona curva sigmoiale con cui stimare l’IC50 richiede di trovare sia gli altipiani inferiori che altipiani. L’altopiano inferiore rappresenta le concentrazioni di un inibitore che forniscono la massima attività inibitoria. In alcuni casi, un composto potrebbe non inibire completamente l’enzima, anche ad alte concentrazioni, a causa di problemi tecnici come la solubilità. Tuttavia, strumenti come GraphPad Prism possono adattarsi all’altopiano inferiore in modo abbastanza accurato. L’altopiano superiore è costituito da concentrazioni dell’inibitore, che sono insufficienti per inibire l’enzima, e quindi l’attività è massima. Entrambi questi altipiani sono cruciali per determinare l’IC50 così come le concentrazioni in mezzo, al fine di trovare la pendenza della curva- quindi l’IC50 può essere derivato dalla forma della curva sigmoide35. La curcumina è scarsamente solubile in acqua, quindi la concentrazione massima utilizzata in questo saggio è limitata, per evitare precipitazioni nella soluzione di saggio. Pertanto, sono state utilizzate soluzioni meno concentrate, che non inibiscono completamente l’attività GST. Ciò ha sollevato questioni per la determinazione dell’altopiano inferiore. Per contrastare questo problema, abbiamo previsto i valori inferiori in base al grafico di regressione non lineare, che ha fornito un IC50 di 31,6 ± 3,6 M per la curcumina (Figura 3A). Per l’acido etacrinico, non c’era bisogno di prevedere i valori per l’altopiano inferiore in quanto questo composto è solubile nella soluzione di analisi e l’IC50 è stato misurato a 6,6 ± 1,1 M.
Questo metodo può essere applicato alle isoforme GST più espresse in , vale a dire GSTA1, GSTM1 o GSTP1. Tuttavia, questo protocollo non è adatto a quantificare l’attività dell’isoforme GSTT1, in quanto LA CDNB non è un substrato per questo sottotipo. 36, 37 anni Nel frattempo, il protocollo può essere leggermente modificato per contrastare questo problema. Ad esempio , utilizzando 1,2-epoxy-3-(4′-nitrophenoxy)propane (ENPP) come substrato per GSTT1 e misurare la quantità di coniugato a 360nm invece di 340nm. Il numero 37 del 37
Le fasi del protocollo possono essere adattate e applicate per testare l’attività GST e il test degli inibitori negli esperimenti di coltura cellulare. La misurazione dell’attività GST sulle cellule trattate con e senza un inibitore GST indicherà se questo composto può essere utilizzato in tale ambiente sperimentale. È particolarmente interessante quando l’inibitore è lipofilo. Per esempio, abbiamo presentato che la curcumina è un potente inibitore GST utilizzando questo protocollo. Tuttavia, la sua applicazione agli studi cellulari può essere limitata, in quanto la molecola è scarsamente solubile in acqua e si degrada rapidamente in media. 31 Un altro miglioramento di questo protocollo è possibile per quanto riguarda la specificità non isoforma del substrato CDNB. L’utilizzo di questo protocollo negli studi sulle cellule fornirà solo informazioni sull’attività complessiva dell’IMPOSTA, ma non sull’attività di un sottotipo preciso dell’IVA. L’aggiunta di un substrato specifico dell’isoforme e/o l’utilizzo di isoformi specifici dell’IVA ricombinante consentirà di testare inibitori dell’IVA specifici isoformi.
Per concludere, descriviamo una procedura completa per testare gli inibitori GST che hanno il potenziale per essere utilizzati in combinazione con la chemioterapia elettrofila. Abbiamo sottolineato i passi cruciali di un enzima GST e analisi di inibizione, per testare potenziale molecola interessante e determinare la loro efficienza come inibitore con valori quantitativi, l’IC50e ilK i . Questo metodo può essere applicato a qualsiasi composto putativo ed eseguito sulle isoforme GST umane più espresse (GSTA1, GSTM1 e GSTP1), o leggermente adattato per eseguire studi di coltura cellulare con inibitori GST o misurare l’attività di altri interessanti isoformi GST di scelta.
| Reagenti | Nome | Concentrazione nella soluzione di saggio | Altro |
| Substrato | CDNB | Misurato Km (mM) | Diluito nel 95% di etanolo. La concentrazione finale di etanolo deve ≤ 5% (v/v) |
| Coniugare substrato | Gsh | 2,5 mM | Diluito in acqua. |
| La concentrazione deve saturare la soluzione. | |||
| Buffer | Pbs | – | pH – 7,1 |
| Enzima | Pool di isoformi GST o isoformi puri | 0,01 unità/mL, determinato sperimentalmente. | Diluito in acqua. |
| Inibitore GST | Potenziale composto di scelta | IC50: 3 concentrazioni che inibiscono al massimo, 3 che minimamente inibiscono e 3 in mezzo. | Diluito in DMSO e poi in acqua, per avere una concentrazione finale di DMSO ≤ 1% (v/v) |
| Ki: 3 concentrazioni intorno all’IC50. | |||
| Parametri | |||
| Temperatura ambiente (25 gradi centigradi) | |||
| pH – 7,1 | |||
| DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
| Etanolo ≤ 5% (v/v) | |||
Tabella 1: Riepilogo dei reagenti e dei parametri da considerare durante un saggio di inibizione dell’IMPOSTA.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla Fondazione CANSEARCH. Gli autori vorrebbero riconoscere la signora Laurence Lesne e il signor Yoann Sarmiento per l’assistenza tecnica, in particolare nello svolgimento degli esperimenti di replica, standardizzando i saggi con inibitori. Discussioni e input fruttuosi di Denis Marino, Dr. Simona Mlakar e Dr. Vid Mlakar sono molto riconosciuti. Ringraziamo la dottoressa Patricia Huezo-Diaz Curtis per il suo aiuto nella narrazione del video. Ringraziamo il dottor Muthukumar per i suoi input sulle previsioni in silico. Ringraziamo anche il signor Darren Hart per il suo aiuto nella lettura a prova di lingua inglese di questo manoscritto.
Materials
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
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